Clonado de una aldo-ceto reductasa de Trypanosoma cruzi (TcAKR) en vectores de expresión específicos y evaluación de la sobre-expresión en parásitos transfectados

GARAVAGLIA, PA ; LAVERRIERE, M; CANNATA, JB; GARCIA, GA

Ascochinga, Cordoba

Congreso; XXXIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2010

Sociedad Argentina de Protozoologia

Recientemente, hemos identificado la primer aldo-ceto reductasa (AKR) de Trypanosoma cruzi, denominada TcAKR. Esta enzima es una óxidoreductasa NADPH-dependiente citosólica, que además de presentar actividad de AKR con los sustratos comunes para esta superfamilia (4-NBA y 2-DHA) también presenta actividad de quinona óxidoreductasa especifica para o–naftoquinonas (o-NQs), tales como β–lapachona, 9,10-fenantrenquinona (9,10-PQ) y 1,2-naftoquinona (1,2-NQ), con la generación concomitante de radicales libres (Garavaglia y col., 2010, Mol Biochem Parasitol 173:132). Algunas NQs poseen actividad tripanocida y hay evidencias que el efecto tóxico se debe a la producción de radicales libres cuando dichas drogas son reducidas por enzimas parasitarias. Con el objeto de determinar si la TcAKR está involucrada en el mecanismo de acción de las o-NQs se evaluará el efecto de estas drogas en epimastigotes de T. cruzi que sobre-expresen la TcAKR. Con este fin el gen TcAKR se clonó en los vectores específicos para expresión en T. cruzi, pRibotex y pTcIndex y se evaluó la sobre-expresión de esta enzima por medición de actividad enzimática y “western blot”. El gen TcAKR conteniendo un His-tag en el extremo 5’ se subclonó en el plásmido pRibotex y los parásitos transfectados con esta construcción se seleccionaron con 500 µg/ml de geneticina. Se confirmó la presencia del gen y ARN mensajero de la TcAKR por PCR y RT-PCR, respectivamente, utilizando “primers” del vector. Sin embargo, mediante “western blot” con un suero anti-His se observó una débil expresión de la enzima y no se obtuvieron diferencias en la actividad enzimática con respecto a los parásitos sin transfectar. Por otro lado, el gen TcAKR se sub-clonó en el vector pTcIndex y los parásitos transfectados con esta construcción se seleccionaron con 200 µg/ml de geneticina e hygromicina B. La expresión de la TcAKR recombinante se indujo en estos parásitos con 5 µg/ml de tetraciclina. A las 72hs post-inducción se observó una expresión máxima de la TcAKR que fue 4 veces mayor a la obtenida en los parásitos no inducidos. Esta sobre-expresión se confirmó por ensayos de actividad enzimática utilizando 4-NBA y 9,10-PQ como sustratos y por “wester blot” con un suero de ratón anti-TcAKR. Por lo tanto, los parásitos transfectados con el plásmido pTcIndex-TcAKR se utilizarán en experimentos subsiguientes a fin de determinar si existen diferencias en las IC50 de las o-NQs cuando estos parásitos sobre-expresan la TcAKR.