Descubrimiento de genes del Trypanosoma cruzi a partir de la secuencia de su genoma. Caracterización de las ciclofilinas y de una nueva glutaredoxina como posibles blancos quimioterapéuticos

RUIZ, AM; BUA, J; GARCIA, GA

Huerta Grande, Cordoba, Argentina

Congreso; VI Congreso de Protozoología y enfermedades parasitarias; 2000

Sociedad Argentina de Protozoologia

Con el objeto de caracterizar  nuevos genes que codifiquen para posibles blancos para la quimioterapia de la enfermedad de Chagas, se utilizó la información generada por la secuenciación al azar de clones de ADNc (ESTs) en el Proyecto Genoma de Trypanosoma cruzi. Se seleccionaron clones cuya secuencia presentó homología con ciclofilinas, moléculas que caltalizan la isomerización entre las dos conformaciones de prolina en las proteínas, y se unen a la ciclosporina A, un péptido con actividad inmunosupresora. También se seleccionaron clones de ADNc con homología con enzimas del metaoblismo del glutatión, sin contraparte en el hospedador mamífero. Se estudiaron catorce ESTs que codificaron para siete genes de ciclofilinas en el parásito y dos ESTs codificantes para una proteína que se denominó TcGrx por presentar homologías con glutaredoxinas bacterianas y con las clases mas ancestrales de glutatión-S-transferasas. Todos estos genes fueron localizados en bandas cromosomales del parásito separados por electroforesis en campo pulsado, reconociendo cada gen a dos cromosomas probablemente homólogos. Las secuencias proteicas deducidas a partir de la secuencias de ADN de las ciclofilinas muestran que son altamente conservadas con la ciclofilinas de otros organismos. Los residuos para la actividad enzimática y la actividad de los posibles inhibidores también se encuentran conservados. La proteína recombinante de uno de esos genes, TcCyp18, fue expresada en bacterias y demostró tener actividad de peptidil prolil cis trans isomerasa, que fue inhibida por ciclosporina A con una IC50 de 18.4+/-0.8 nM. Debido a que la ciclosporina A ha demostrado una marcada actividad anti-parasitaria en el T. cruzi y otros organismos se encuentra en experimentación la actividad de derivados no inmunosupresores de la ciclosporina A in vivo en in vitro, la identificación de sus moléculas blanco en el parásito y la elucidación de su mecanismo de acción. El gen completo de la TcGrx se obtuvo por hibridación de uno de los ESTs a una genoteca de T. cruzi realizada en cósmidos, obteniéndose un marco abierto de lectura de 936 pb codificando una proteína de 312 aa con el patrón completo de glutaredoxinas y un sitio activo conteniendo dos cys (CPFC). Los ensayos de hibridación sugieren que los genes TcGrx y TcCyp18 estarían presentes en una copia única por genoma haploide del parásito. La comparación de la secuencia de TcGrx en el banco de datos de estructuras tidimensionales (pdb) permitió seleccionar a la Grx3 de E. coli como templado para realizar el modelado molecular de la proteína de T. cruzi. El análisis del modelo permitió identificar la estructura típica de la familia tioredoxina/glutredoxina. La expresión de la TcGrx y de los otros seis genes de ciclofilinas, el análisis de su actividad enzimática y la búsqueda de posibles inhibidores de dicha actividad, definirán su rol en el metabolismo del parásito y su utilidad como nuevos blancos de drogas tripanocidas.