Selección in vitro de Cebolla (Allium cepa L.)

MARINANGELI, PABLO; DELUCHI, BERNARDO; CURVETTO, NÉSTOR

Río Cuarto

Congreso; XXIII Reunión Argentina de Fisiología Vegetal; 2000

SAFV

En cebolla hemos logrado una vía de regeneración eficiente de microvástagos tanto por organogénesis directa desde inflorescencias inmaduras (ii) como por embriogénesis a partir de callos de embriones cigóticos (ec) (1, 2). Siguiendo a la transformación genética se utilizan sistemas de selección in vitro aprovechando la resistencia que confieren algunos de los transgenes introducidos a las células transformadas a sustancias inhibitorias de la multiplicación de células vegetales. Así solo se multiplicarán las células que hayan expresado el gen que confiere resistencia al mismo permitiendo el aislamiento de los eventos de transformación. Por lo anterior, para cada genotipo se necesita establecer el agente de selección y la concentración mínima capaz de inhibir el crecimiento de las células normales. El objetivo de este trabajo fue obtener la concentración mínima efectiva de kanamicina (Km) o geneticina (G418) capaz de reducir significativamente la producción de microvástagos desde ii, el crecimiento de callos de ec y la inducción de callos desde ec, del cultivar Valcatorce INTA. Para la regeneración de vástagos desde ii se usaron dosis crecientes de Km (0, 10, 20, 30, 40 y 50 mg.L-1) en medio BDSRD y se observó una marcada disminución de la producción de vástagos al aumentar las dosis, llegando a la inhibición total de la producción de vástagos con 30 mg.L-1 de Km. A esta concentración de Km los escapes fueron muy escasos y los vástagos producidos deformados y albinos.La selección de callos fue muy ineficiente con Km e incluso con G418 cuando los callos tenían un peso fresco inicial promedio de 550 mg (tabla 1). Para dosis de 0, 10, 20, 40, 100 y 200 mg.L-1 de ambos antibióticos y durante un mes de cultivo la Km no redujo significativamente el crecimiento de los callos y la G418 redujo su crecimiento en forma significativa a partir de los 100 mg.L-1. Cuando se trabajó con callos con peso fresco promedio inicial de 150 mg, la Km redujo significativamente el crecimiento de los callos a una concentración de 200 mg.L-1, aunque a estos niveles los callos crecieron 848 mg/g de callo en un mes, comparado con los 2273 mg/g de callo del control. La G418 redujo el crecimiento de los callos en forma significativa a partir de los 20 mg.L-1, pasando de los 2270 mg/g de callo del control a 903 mg/g de callo con 20 mg.L-1 de G418 y llegando a un crecimiento mínimo 129 mg/g de callo con 200 mg.L-1 (tabla 1).Ya que el tamaño del explanto incide marcadamente en la selección se usó luego uno menor y G418 por su mayor efectividad. Así, Se probaron las mismas concentraciones y se usaron callos de 20 mg de peso fresco inicial promedio. Al final del primer mes de cultivo los callos en presencia de 10 mg.L-1 de G418 crecieron aproximadamente la mitad que los callos control, aunque entre los 30 y 60 días crecieron casi lo mismo. Con 100 mg.L-1 de G418 hubo una fuerte inhibición del crecimiento entre los 30 y 60 días (tabla 1).Los ec cultivados durante una semana en medio BDSC se expusieron a 0, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 y 200 mg.L-1 de G418 en medio BDSC durante dos meses. Se observó una inhibición creciente de la inducción de callos hasta llegar a ser completa a partir de los 50 mg.L-1 de G418 (figura 1).G418 resultó ser más efectiva que Km para inhibir la inducción de callos desde ec y el crecimiento de callos ya establecidos. Las dosis mínimas efectivas fueron 50 mg.L-1 para ec y entre 40 y 100 mg.L-1 para callos de 20 mg.