Necesidad del uso de inhibidor de ribonucleasa para el diagnóstico molecular de muestras con eosinofilia

CARBONELL, MARÍA MAGDALENA; BRAGÓS, IRMA MARGARITA; PRATTI, ARIANNA; OJEDA MARA ; WILLIAMS, MARCELA; CALVO, KARINA

Buenos Aires

Congreso; 72ª Congreso de Bioquímica; 2017

ABA - ASOCIACION BIOQUIMICA ARGENTINA

Introducción: Los eosinófilos (Eo) son granulocitos polimorfonucleares que se diferenciana partir de una célula madre hematopoyética en la médula ósea. Dentro de sus funcionesprotectoras se encuentra la producción de radicales libres y liberación del contenido de susgránulos citoplasmáticos. Las proteínas que éstos contienen son responsables de muchasfunciones proinflamatorias y citotóxicas. Dentro de los gránulos específicos se encuentranla Proteína básica principal, Proteína catiónica eosinofílica (ECP), Neurotoxina derivada deeosinófilos (EDN), Peroxidasa de eosinófilo, hidrolasas lisosomales e histaminasa. La ECP(RNAsa 3) y EDN (RNAsa 2) pertenecen a la superfamilia RNasa A y la función de estasenzimas es hidrolizar y degradar el RNA. Objetivos: Establecer pautas en el laboratorio deBiología Molecular para obtener ADN complementario (ADNc) a partir de ARN extraído demuestras con alto porcentaje de Eo. Materiales y métodos: Se incluyeron en el estudio 100muestras, 59 de sangre periférica (SP) y 41 de médula ósea (MO). Se realizó el frotis decada muestra efectuándose, además, en las muestras de SP el recuento leucocitario y lafórmula leucocitaria relativa. Se realizó extracción rápida de ARN utilizando kit Direct-zolRNA MiniPrep (Zymo Research). Luego se obtuvo el ADNc mediante retrotranscripción (RT)utilizando SuperScript IV (Invitrogen) según protocolo recomendado por el fabricante. Todaslas muestras fueron procesadas con y sin el agregado de Inhibidor Recombinante deRibonucleasas (RNasin) en la RT. La eficiencia de la RT se evaluó mediante amplificación degenes controles (ABL y PBGD). Resultados: Al observar el frotis, se constató que tres muestrasde SP (1, 2 y 3) presentaban leucocitosis con eosinofilia relativa y absoluta; la muestra1 con 35.500 leucocitos/mm3 y 58% de Eo, la 2 con 115.500 leucocitos/mm3 y 90% deEo y la muestra 3 con 17.000 leucocitos/mm3 y 38% de Eo. Además en dos muestras deMO (4 y 5) se observó hipercelularidad con eosinofilia marcada. Las muestras restantesno presentaban la eosinofilia. En todas las muestras en las que se utilizó RNasin en la RTse logró un ADNc de buena calidad, lo cual fue evidenciado por la amplificación de genescontroles. Esto también se observó en muestras sin eosinofilia y sin el uso de RNasin. Sinembargo, en ninguna de las muestras con eosinofilia y sin RNasin se obtuvo amplificaciónde los genes controles. Conclusiones: Si bien, el uso del RNasin está recomendado en losprotocolos de retrotranscripción, éste puede ser prescindible en las muestras sin eosinofilia.Sin embargo, teniendo en cuenta nuestra evidencia experimental consideramos indispensableel uso de RNasin para realizar la RT en muestras con alto porcentaje de Eo. Ésteactúa de manera específica contra RNAsas, entre ellas las pertenecientes a la familia de laRNAsa A, presentes en los Eo.