DETECCIÓN DEL GEN DE LA NUCLEOFOSMINA (NPM1) MUTADO EN LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS (LMA) MEDIANTE AMPLIFICACIÓN Y ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

CALVO, KL; OJEDA, MJ; LAVORNA, S; ANMATUNA, E; ALONSO, C; TARGOVNIK, HM; LO-COCO, F; NOGUERA, NI

Salta

Congreso; XVIII Congreso Argentino de Hematología, X Jornadas del Grupo Rioplatenese de Citometría de Flujo.; 2007

Sociedad Argentina de Hematología

La detección de aberraciones cromosómicas y genéticas en blastos de LMAs es necesaria a fines de efectuar el diagnóstico y seguimiento de estas enfermedades, siendo un pre-requisito para la aplicación de una terapia acorde al riesgo en cada paciente. Recientemente ha sido identificada una nueva alteración molecular en NPM1 que produce su dislocación al citoplasma (NPMc+). Esta mutación, fue reportada en un 35% de LMAs, de todos los subtipos morfológicos excepto M3, M4Eo y M7. Los pacientes con NPM1 mutado tienen una respuesta a la quimioterapia de inducción relativamente buena, una alta asociación a cariotipo normal y a la mutación del gen FLT3 (FL3-ITD, duplicación interna en tandem). Una actualización de la clasificación de LMAs con la inclusión NPMc+ parece estar justificada, dado que este subgrupo presenta características moleculares, patológicas y clínicas específicas. Como evento clonal principal de LMAs con cariotipo normal, la mutación específica en NPM1 representa una herramienta única para evaluar remisión molecular, identificar enfermedad residual mínima y predecir recaída hematológica por lo que hemos llevado a cabo el diseño y puesta a punto de un método para la detección de NPM1 mutado. A la fecha 29 mutaciones que afectan el exón 12 de la NPM han sido descriptas, básicamente consisten en: a)-una inserción de cuatro nucleótidos, variables, en posición 959 (número de acceso en Gene Bank NM_002520); o b)-una deleción de la secuencia GGAGG en posición 965?969, más una substitución con 9 nucleótidos extra. Todas las mutaciones descriptas se asocian a la ganancia de 4 o 5 pares de bases (pb). Amplificamos un fragmento de 206 pb a partir de 1 ul de cDNA, empleando las siguientes condiciones de reacción: volumen final 25 ul, 20 pmoles de cada primer, (NPM-F: CTTCCCAAAGTGGAAGCC, NPM-R: GGAAAGTTCTCACTCTGC), dNTPs 200mM, ClMg 1,5 mM, Buffer Taq 1X, 1 U Taq polimerasa. Se realizó una desnaturalización inicial a 94ºC 5? seguida de 30 ciclos de 94ºC 45??, 54ºC 1? y 72ºC 30??. El fragmento amplificado fue corrido en gel de poliacrilamida al 12 % (arcrilamida: bis ?acrilamida 39:1) obteniendo un patrón de dos bandas en los pacientes positivos y sólo una banda en aquellos negativos. Las bandas fueron extraídas del gel y secuenciadas verificando que una de las bandas corresponde al alelo normal y la otra al mutado. La técnica fue validada realizando el análisis de 7 muestras de pacientes NPMc+ y 10 de NPMc- las cuales fueron caracterizadas mediante secuenciación automática. La concordancia entre ambas técnicas fue del 100 %, por lo que sugerimos que este ensayo puede ser implementado en el análisis de rutina para la caracterización molecular de LMAs. Esto resulta especialmente importante para extender la monitorización molecular a los casos con cariotipo normal que carecen de un marcador específico.