Screening por HRM (High Resolution melting) de mutaciones de importancia diagnóstica en Neoplasias Mieloproliferativas crónicas (NMPC) bcr-abl negativas.

OJEDA, MARA; WILLIAMS, GLADYS; MARONI, GEORGINA; MISAÑA, MARINA; PRATTI, ARIANNA

Rosario

Jornada; Primeras Jornadas de Ciencia y Tecnología FBIOYF - UNR.; 2021

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. UNR.

Introducción: Las NMPc BCR-ABL negativas clásicas incluyen Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Esencial (TE) y Mielofibrosis Primaria (MFP). La MFP se asocia a una sobrevida significativamente acortada, siendo la tasa de evolución leucémica entre 5-20%. Se han identificado mutaciones conductoras o ?drivers?, directamente relacionadas al fenotipo mieloproliferativo, en los genes JAK2 (JAK2V617F), MPL (W515L y W515K) y CALR. Las mutaciones en CALR consisten en deleciones y/o inserciones en el exón 9, siendo más frecuentes una deleción de 52 pares de bases (pb) (tipo 1) y una inserción de 5 pb (tipo 2). Más del 95% de los casos de PV presentan la mutación JAK2V617F. En cuanto a los casos de MFP y TE, 50-60% son JAK2V617F positivos, 25-35% son CALR positivos, 3-10% son MPL W515L/K positivos y 10-15% no presentan ninguna mutación en los genes drivers y se clasifican como Triple Negativos (TN). El objetivo de este trabajo fue la puesta a punto de técnicas de PCR en Tiempo Real (RT-PCR) con posterior análisis por HRM y secuenciación, para el screening de mutaciones en el exón 9 de CALR y en el exón 10 de MPL. Materiales y métodos: Se extrajo ADN genómico de 123 pacientes con NMP y de 10 controles sanos. Para la puesta a punto de las técnicas de HRM, se llevaron a cabo reacciones de RT-PCR, utilizando una mezcla real fluorescente con EvaGreen. Para cada gen se validaron los sets de cebadores seleccionados de la bibliografía o diseñados y se pusieron a punto los parámetros de PCR y de HRM. Para el screening de mutaciones en CALR se analizaron por duplicado 56 pacientes de los cuales 10 fueron testigos para la mutación tipo 1, 10 para la mutación tipo 2, 7 para otras mutaciones, 10 testigos CALR negativos y 19 pacientes con TE o MFP JAK2 negativo. Para el screening de mutaciones en MPL se estudiaron 77 pacientes por duplicado, de los cuales 4 fueron testigos W515L, 2 W515K, 10 controles sanos y 60 con TE o MFP clasificados como TN. Para la validación de las metodologías de HRM, aquellos productos de amplificación con patrones de melting diferentes fueron purificados y secuenciados. Resultados: En el caso de las mutaciones en CALR, los patrones de melting permitieron distinguir entre los diferentes tipos de mutaciones y de los testigos CALR negativos. De los 19 pacientes analizados, 3 presentaron patrones de melting coincidentes con las mutaciones de tipo 2, 2 fueron coincidentes con las mutaciones de tipo 1 y el resto coincidieron con los testigos negativos. En el caso de las mutaciones en MPL, se obtuvieron patrones de melting similares en los testigos MPL W515L/K pero distintos a los controles normales. De los 60 pacientes previamente clasificados como TN se obtuvieron patrones de melting diferentes en 7 pacientes, de los cuales luego de la secuenciación se pudo corroborar la presencia de las siguientes mutaciones: W515G, W515C, W515R, S505N y la mutación pL513_R514IinsTSWGLLLL (no descripta previamente), en dos pacientes la secuenciación se encuentra pendiente. Conclusiones: El análisis por HRM puede ser considerado como una herramienta diagnóstica eficaz debido a su alta sensibilidad, bajo costo y tiempo de procesamiento. Además, permite hallar nuevas variantes no descriptas, como la mutación en MPL pL513_R514IinsTSWGLLLL. En este trabajo, por esta metodología se pudieron identificar mutaciones en MPL en el 12% de los pacientes caracterizados como TN, lo que confirma la existencia de una entidad neoplásica y discrimina de un proceso reactivo.