MUTACIONES EN CALR Y MPL EN TROMBOCITEMIA ESENCIAL (TE) Y MIELOFIBROSIS PRIMARIA (MFP): SCREENING POR HRM (HIGH RESOLUTION MELTING)

OJEDA MARA JORGELINA; WILLIAMS MARCELA; MARONI GEORGINA; MISAÑA MARINA; PRATTI ARIANNA FLAVIA

Mar del Plata

Congreso; XXV Congreso Argentino de Hematología, V Simposio Conjunto de la Asociación Hematológica Europea (EHA) y la Sociedad Argentina de Hematología (SAH), I Congreso Argentino de Hematología Pediátrica, XI Congreso del Grupo Rioplatense de Citometría de Flujo y; 2021

Sociedad Argentina de Hematología (SAH)

MUTACIONES EN CALR Y MPL EN TROMBOCITEMIA ESENCIAL (TE) Y MIELOFIBROSIS PRIMARIA (MFP): SCREENING POR HRM (HIGH RESOLUTION MELTING)Ojeda, M.; Williams, G.; Maroni, G.; Misaña, M.; Pratti, A.Facultad De Ciencias Bioquímicas Y Farmacéuticas. Universidad Nacional De Rosario, Santa Fe, ArgentinaTipo: Serie de casos - Categorias: Mieloproliferativos Phi negativos, Clínica AdultosIntroducción: La detección de mutaciones drivers en CALR y MPL es de importancia para el diagnóstico de los pacientes con TE y MFP JA2V617F negativos. Las mutaciones en CALR consisten en deleciones y/o inserciones en el exón 9, siendo más frecuentes una deleción de 52 pares de bases (pb) (tipo 1) y una inserción de 5 pb (tipo 2). Las mutaciones en el exón 10 de MPLafectan al W515 y a la S505, siendo más frecuentes las mutaciones W515L y W515K. De los casos de TE y MFP 50-60% son JAK2 positivos, 25-35% son CALR positivos, 5-10% son MPL positivos y 10-15% no presentan ninguna mutación en los genes drivers y se clasifican como Triple Negativos (TN). Las metodologías actuales para el estudio de estas alteraciones incluyen PCR alelo específica y secuenciación directa. La PCR alelo específica tiene una alta sensibilidad pero no es práctica para detectar todas las mutaciones encontradas en estos genes, y además no permite detectar mutaciones no descriptas. La secuenciación es costosa, menos sensible y consume mucho tiempo. El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es una técnica de análisis post-PCR que permite detectar cambios de una sola base dentro de una secuencia de 200-300 pb. El método se basa en la detección de diferencias en las curvas de fusión del ADN y consiste en una PCR en Tiempo Real (RTPCR), seguida de la adquisición de las curvas de fusión y su análisis mediante software. Se ha demostrado que HRM es un método sensible, sencillo y de bajo costo para la detección rápida de mutaciones. Objetivos: Puesta a punto de técnicas de HRM, para el screening de mutaciones en el exón 9 de CALR y en el exón 10 de MPL. Material y métodos: Se extrajo ADN genómico de 118 pacientes con TE o MFP y de 10 controles sanos. Para la puesta a punto de las técnicas deHRM, se llevaron a cabo reacciones de RT-PCR, utilizando una mezcla real con el fluoróforo EvaGreen. Para cada gen se validaron los sets de cebadores seleccionados y se pusieron a punto los parámetros de PCR y de HRM. Para el screening de mutaciones en CALR se analizaron por duplicado 56 pacientes: 10 testigos de la mutación tipo 1, 10 de la mutación tipo 2, 7 de otras mutaciones, 10 testigos CALR negativos y 19 pacientes con TE o MFP JAK2 negativo. Para el screening de mutaciones en MPL se estudiaron 72 pacientes por duplicado, de los cuales 4 fueron testigos W515L, 2 testigos W515K, 10 controles sanos y 55 con TE o MFP clasificados como TN. Los resultados se analizaron mediante la aplicación gratuita "hrmR - HRM in R". Para la validación de las metodologías de HRM, aquellos productos de amplificación con curvas de melting diferentes a los controles fueron purificados y secuenciados. Resultados: En el estudio de CALR, cada tipo de mutación (tipo 1, tipo 2 y otras) mostró un perfil de melting único y diferente al normal. De los 19 pacientes analizados, 3 presentaron patrones de melting compatibles con las mutaciones de tipo 2, 2 fueron compatibles con las mutaciones de tipo 1 y el resto coincidieron con los testigos negativos, lo cual fue corroborado por secuenciación. En el análisis de MPL, se obtuvieron patrones de melting similares en los testigos MPL W515L/K pero distintos a los controles normales. De los 55 pacientes previamente clasificados como TN se obtuvieron patrones de melting diferentes en 5 pacientes, de los cuales luego de la secuenciación se pudo corroborar la presencia de las siguientes mutaciones: W515G, W515C, W515R, S505N y la inserción pL513_R514IinsTSWGLLLL (no descripta previamente). Conclusiones: El análisis por HRM es un método rápido, de alta sensibilidad y bajo costo que puede ser utilizado en la práctica clínica. Además, permite hallar nuevas variantes no descriptas, como la mutación en MPL pL513_R514IinsTSWGLLLL. En este trabajo se pudieron identificar mutaciones en MPL en el 9,1% de los pacientes caracterizados como TN, lo que confirma la existencia de una entidad neoplásica y discrimina de un proceso reactivo.