Construcción de un derivado recombinante del bacteriófago Qb para su aplicación como control en el diagnóstico de virus con genoma a ARN

VILLANOVA, V.; ADRIANA ANGELICA GIRI; GARDIOL, DANIELA

Rosario

Congreso; XXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario (SBR); 2002

Sociedad de Biología de Rosario (SBR)

La aplicación de la técnica de RT-PCR para la detección de virus con genoma a ARN es muy utilizada en el diagnóstico clínico y la investigación. Debido a la labilidad del ARN es imprescindible un control estable para verificar la eficiencia en el procesamiento de las muestras y en la amplificación. Aquí se presenta el desarrollo de un control interno estable que se adicionaría a la muestra para ser procesado y co-amplificado utilizando los mismos cebadores que para el virus diana. Para esto se propone la utilización de un bacteriófago Qb quimera. Qb es un colifago con genoma a ARN simple hebra del cual se dispone su genoma clonado como ADNc en un vector de expresión bajo el control del promotor T7 (pBRT7Qb). La estabilidad en el tiempo y la infectividad de las partículas fágicas obtenidas con este sistema regulable fueron ensayadas en E. coli durante un año, obteniéndose un título constante en el tiempo de 108 unidades formadoras de placas por mililitro de lisado. Se introdujeron los cebadores KY78 y KY80, ampliamente usados para la detección del virus de hepatitis C (HCV), en el genoma del fago. Dichos cebadores se clonaron dentro del marco de lectura de la proteína A1 de Qb, en una región donde se encuentran sitios de restricción únicos para Bst98 I y Nsi I, limitando un fragmento de 200 pb. Fueron diseñados oligonucleótidos para la introducción de los cebadores KY78 y KY80 en el genoma del fago mediante técnica de PCR. El amplicón resultante fue clonado en el pBRT7Qb, sustituyendo en Qb el fragmento salvaje correspondiente por un fragmento de igual tamaño flanqueado por KY78 y KY80. El fago recombinante obtenido (Qb78-80) se ensayó en experimentos de infección de E. coli, siguiendo la misma estrategia que la utilizada para generar lisados a partir del vector que contenía el genoma del fago salvaje. Dichos experimentos demostraron la funcionalidad y viabilidad de Qb78-80 aunque los títulos obtenidos en estas infecciones fueron menores que los correspondientes para el fago salvaje. Para confirmar los datos obtenidos in vivo, fue realizado un ensayo de RT-PCR a partir de los lisados de Qb78-80 usando los cebadores para HCV, KY78 y KY80. Para ello previamente se extrajo el ARN de Qb78-80 en paralelo al procesamiento de un plasma positivo para HCV mediante un sistema comercial. Los productos obtenidos de la amplificación fueron los esperados para ambos casos: un fragmento de 200 pb para Qb78-80 y uno de 244 pb para HCV. El éxito alcanzado en el desarrollo de un control estable para el diagnóstico molecular de HCV sugiere a esta estrategia como una herramienta útil para la obtención de controles estables para el diagnóstico molecular de otros virus con genoma a ARN.