Construcción y utilización de un control interno (CI) derivado del fago Qb en el diagnóstico de virus a ARN.

VILLANOVA, G. VANINA; ADRIANA ANGELICA GIRI; GARDIOL, DANIELA

Rosario

Congreso; VI Congreso XXIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2003

Sociedad de Biología de Rosario (SBR)

La aplicación de la técnica de RT-PCR para la detección de virus con genoma a ARN es muy utilizada en el diagnóstico clínico y la investigación. Debido a la labilidad del ARN es imprescindible un control estable para verificar la eficiencia del procesamiento de las muestras y en la amplificación. Aquí se presenta el desarrollo de un control interno (CI) estable que se adicionaría a la muestra para ser procesado y co-amplificado utilizando los mismos cebadores que para el virus diana. Para esto se propone la utilización de un bacteriófago Qb quimera. Qb es un colifago con genoma a ARN simple hebra del cual se dispone su genoma clonado como ADNc en un vector de expresión bajo el control del promotor T7 (pBRT7Qb). Se introdujeron los cebadores KY78 y KY80, ampliamente usados para la detección del virus de hepatitis C (HCV), en el genoma del fago. Dichos cebadores se clonaron dentro del marco de lectura de la proteína A1 de Qb, limitando un fragmento de 200 pb, sustituyendo en Qb el fragmento salvaje correspondiente. El fago recombinante obtenido (Qb78-80) se ensayó en experimentos de infección de E. coli, los cuales demostraron la funcionalidad y viabilidad de Qb78-80. Para confirmar los datos obtenidos in vivo, fue realizado un ensayo de RT-PCR a partir de los lisados de Qb78-80 usando los cebadores para HCV, KY78 y KY80. El fago recombinante obtenido fue resistente a ARNasa, estable al menos por 64 días a 4ºC y pudo ser co-amplificado satisfactoriamente con muestras HCV (+). Ambos productos de amplificación fueron detectados por hibridación con sondas específicas. Se logró así el desarrollo de un CI específico para la detección de HCV por RT-PCR. La estrategia utilizada para su construcción puede aplicarse a otros virus con genoma a ARN cuya detección sea importante para la adopción de estrategias de prevención o terapéuticas.