Desarrollo y aplicación de un control interno estable para el diagnóstico de hepatitis C por RT-PCR.

VILLANOVA, G. VANINA; GARDIOL, DANIELA; ADRIANA ANGELICA GIRI

Mar del Plata

Congreso; Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas (SAIC, SAI, SAFE, SAB, SAP, SAN, SAF); 2004

SAIC, SAI, SAFE, SAB, SAP, SAN, SAF

El HCV es el principal causante de las hepatitis no-A no-B. El 75 % de los individuos infectados presentan infecciones crónicas que pueden progresar a cirrosis y hepatocarcinoma. HCV es un virus con genoma ARN (+) perteneciente a la familia Flaviviridae y se transmite principalmente por vía parenteral. Desde 1990, los países desarrollados han implementado métodos moleculares para la evaluación de los donantes lo que ha contribuido a disminuir la incidencia de la infección por HCV adquirida por vía transfusional. La inclusión de un CI que permita verificar la eficiencia de todo el procedimiento es uno de los requisitos necesarios para la implementación de dichos métodos moleculares.El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de un CI estable (CIHCV) para ser incorporado en un método de detección de HCV en plasma por RT-PCR y la ulterior estandarización del procedimiento.El CIHCV es una partícula fágica con genoma ARN (+) en el cual se han incorporado las secuencias nucleotídicas correspondientes a los cebadores utilizados para la detección HCV. Es resistente a ARNasas, estable a 4ºC al menos 585 días y puede ser co-amplificado satisfactoriamente con muestras HCV (+). Una dilución del CIHCV se incorpora a la muestra y tanto la extracción de ARN como la RT-PCR son realizadas conjuntamente. La extracción de ARN se realiza a partir de 100 ml de plasma con tiocianato de guanidina, precipitación con alcoholes y resuspensión en 100 ml de agua tratada con dietilpirocarbonato. 10 ml de ARN son utilizados para la RT-PCR donde uno de los cebadores esta biotinilado en el extremo 5’. Los productos amplificados obtenidos a partir de HCV y del CIHCV, son detectados por hibridación con sondas específicas: 5 ml del producto de amplificación son utilizados para la hibridación en fase líquida con cada una de las sondas conjugadas a fluoresceína, en tubos separados. Finalmente los híbridos se capturan en microplacas cubiertas con estreptavidina, se detectan con un anticuerpo anti-fluoresceína y reacción colorimétrica.El límite de detección estimado para este método de diagnóstico de HCV es de 50 copias por reacción.El ensayo aquí presentado cumple con los requisitos del Consenso Nacional Argentino sobre Hepatitis C, y podría ser de utilidad para evaluar su uso en Bancos de Sangre de nuestro país.