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El c¨¢ncer cervical es una de las neoplasias más comunes que afecta los órganos reproductivos de la mujer. En Latinoamé¦rica ocupa el primer lugar en incidencia, siendo en Bs.As. de 25,4/100.000 mujeres (Golijow et al, 2005). La prevenci¨®n del c¨¢ncer cervical se basa en la realizaci¨®n peri¨®dica del Papanicolaou (Pap) y la colposcop¨ªa. Las lesiones cervicales se clasifican seg¨²n su severidad en lesiones escamosas intraepiteliales de bajo o alto grado (LSIL o HSIL) e invasivas. El Pap ha contribuido a reducir la incidencia del c¨¢ncer cervical. Sin embargo, el diagnástico de neoplasias cervicales en mujeres controladas periodicamente con el Pap sugiere que esta metodología ha llegado al límite de su sensibilidad para la detección precoz. Ha sido establecido que la infección con tipos oncogénicos de papillomavirus humanos (HPV) es el evento clave en el desarrollo del c¨¢ncer cervical (Zur Hausen, 1996). Ademas, las infecciones persistentes con HPV oncog¨¦nicos en mujeres con lesiones cervicales aumenta el riesgo de progresi¨®n a c¨¢ncer en el tiempo. La imposibilidad de cultivar el virus, el escaso significado de las pruebas serol¨®gicas y la reducida sensibilidad de la inmunohistoqu¨ªmica, indica la b¨²squeda de ¨¢cidos nucleicos virales como la mejor estrategia de diagn¨®stico de HPV. Dada la ausencia en nuestro pa¨ªs de m¨¦todos comerciales para la detecci¨®n de secuencias de HPV, surge la necesidad de desarrollos regionales. El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un ensayo molecular para la detecci¨®n de HPV y tipificaci¨®n de los 5 tipos oncog¨¦nicos de mayor incidencia como herramienta para el diagn¨®stico precoz de c¨¢ncer cervical. Se desarroll¨® el L1HPVPCR, un ensayo basado en la Reacci¨®n en Cadena de la Polimerasa (PCR) con revelado colorim¨¦trico para la detecci¨®n de HPV mucosotr¨®picos y tipificaci¨®n de los HPV oncog¨¦nicos de mayor incidencia (16,18,31,33,-35). Se optimiz¨® la t¨¦cnica de PCR con los cebadores gen¨¦ricos MY11 y MY09 biotinilado (Manos et al, 1989), que permiten amplificar un fragmento altamente conservado de la prote¨ªna mayor del c¨¢pside L1 de los HPV mucosotr¨®picos. Los amplicones biotinilados son hibridizados en fase l¨ªquida a una sonda gen¨¦rica conjugada a fluoresce¨ªna, capturados a una microplaca revestida con estreptavidina y detectados con anticuerpo antifluoresce¨ªna conjugado con peroxidasa y un crom¨®geno (Figura 1). Las muestras HPV-positivas son tipificadas con sondas fluoresceinadas tipo-espec¨ªficas para HPV-16,-18,-31,-33 y -35, con un procedimiento similar al descripto para la sonda gen¨¦rica. La idoneidad de muestras HPV-negativas es verificada mediante amplificaci¨®n de un fragmento del gen de ¦Â-globina humana. El L1HPVPCR fue sensible (10-100 copias de HPV/reacci¨®n), reproducible y de f¨¢cil ejecuci¨®n. Para convalidar su aplicabilidad diagn¨®stica se analizaron 130 muestras de cepillado cervical: 94 con citolog¨ªa normal, 24 LSIL y 12 HSIL. El ADN viral fue detectado en el 54% (70/130), de los cuales el 57% (40/70) pertenec¨ªa a HPV oncog¨¦nicos. El 55% (52/94) de las muestras con citolog¨ªa normal, fue concordante en el ensayo molecular. Un resultado doble-negativo (citolog¨ªa normal y ausencia de ADN de HPV oncog¨¦nico) indica mejor pron¨®stico contra futuras lesiones HSIL que tres resultados negativos consecutivos en la citolog¨ªa. El 45% (42/94) restante de las muestras con citolog¨ªa normal present¨® secuencias de HPV, detect¨¢ndose tipos oncog¨¦nicos en el 21% (20/94) de las mismas. Mujeres con citolog¨ªa normal que resulten positivas al ADN de HPV oncog¨¦nicos presentan un riesgo 100 veces mayor de desarrollar HSIL, respecto a las mujeres negativas para ambas determinaciones. Entre las muestras que presentaron LSIL, el 75% (18/24) fue positiva para HPV, tipific¨¢ndose HPV oncog¨¦nicos en el 42% (10/24). Todas las muestras HSIL que presentaron secuencias de HPV (83%; 10/12) correspondieron a tipos oncog¨¦nicos. La regresi¨®n de las lesiones siempre tiene lugar posteriormente a la erradicaci¨®n viral, lo cual podr¨ªa explicar el resultado negativo para HPV en 6 de las muestras LSIL y 2 HSIL. Adem¨¢s, el L1HPVPCR fue utilizado para demostrar la asociaci¨®n de HPV en muestras de tejidos embebidos en parafina de mucosa cervical. Este an¨¢lisis permiti¨® correlacionar la degradaci¨®n del oncosupresor h-Dlg por la oncoprote¨ªna E6 de HPV oncog¨¦nicos con los procesos de transformaci¨®n maligna en el trabajo publicado por nuestro grupo (Cavatorta et al, 2004). Estos resultados indican al L1HPVPCR como una herramienta de alta sensibilidad para la detecci¨®n precoz del c¨¢ncer cervical. Considerando la falta de acceso a los ensayos de detecci¨®n y tipificaci¨®n de HPV comerciales, el ensayo aqu¨ª presentado constituye un instrumento de importancia para asegurar la calidad y continuidad de los resultados, y permitir un seguimiento m¨¢s eficiente de las mujeres con riesgo de desarrollar c¨¢ncer cervical.et al, 2005). La prevenci¨®n del c¨¢ncer cervical se basa en la realizaci¨®n peri¨®dica del Papanicolaou (Pap) y la colposcop¨ªa. Las lesiones cervicales se clasifican seg¨²n su severidad en lesiones escamosas intraepiteliales de bajo o alto grado (LSIL o HSIL) e invasivas. El Pap ha contribuido a reducir la incidencia del c¨¢ncer cervical. Sin embargo, el diagn¨®stico de neoplasias cervicales en mujeres controladas peri¨®dicamente con el Pap sugiere que esta metodolog¨ªa ha llegado al l¨ªmite de su sensibilidad para la detecci¨®n precoz. Ha sido establecido que la infecci¨®n con tipos oncog¨¦nicos de papillomavirus humanos (HPV) es el evento clave en el desarrollo del c¨¢ncer cervical (Zur Hausen, 1996). Adem¨¢s, las infecciones persistentes con HPV oncog¨¦nicos en mujeres con lesiones cervicales aumenta el riesgo de progresi¨®n a c¨¢ncer en el tiempo. La imposibilidad de cultivar el virus, el escaso significado de las pruebas serol¨®gicas y la reducida sensibilidad de la inmunohistoqu¨ªmica, indica la b¨²squeda de ¨¢cidos nucleicos virales como la mejor estrategia de diagn¨®stico de HPV. Dada la ausencia en nuestro pa¨ªs de m¨¦todos comerciales para la detecci¨®n de secuencias de HPV, surge la necesidad de desarrollos regionales. El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un ensayo molecular para la detecci¨®n de HPV y tipificaci¨®n de los 5 tipos oncog¨¦nicos de mayor incidencia como herramienta para el diagn¨®stico precoz de c¨¢ncer cervical. Se desarroll¨® el L1HPVPCR, un ensayo basado en la Reacci¨®n en Cadena de la Polimerasa (PCR) con revelado colorim¨¦trico para la detecci¨®n de HPV mucosotr¨®picos y tipificaci¨®n de los HPV oncog¨¦nicos de mayor incidencia (16,18,31,33,-35). Se optimiz¨® la t¨¦cnica de PCR con los cebadores gen¨¦ricos MY11 y MY09 biotinilado (Manos et al, 1989), que permiten amplificar un fragmento altamente conservado de la prote¨ªna mayor del c¨¢pside L1 de los HPV mucosotr¨®picos. Los amplicones biotinilados son hibridizados en fase l¨ªquida a una sonda gen¨¦rica conjugada a fluoresce¨ªna, capturados a una microplaca revestida con estreptavidina y detectados con anticuerpo antifluoresce¨ªna conjugado con peroxidasa y un crom¨®geno (Figura 1). Las muestras HPV-positivas son tipificadas con sondas fluoresceinadas tipo-espec¨ªficas para HPV-16,-18,-31,-33 y -35, con un procedimiento similar al descripto para la sonda gen¨¦rica. La idoneidad de muestras HPV-negativas es verificada mediante amplificaci¨®n de un fragmento del gen de ¦Â-globina humana. El L1HPVPCR fue sensible (10-100 copias de HPV/reacci¨®n), reproducible y de f¨¢cil ejecuci¨®n. Para convalidar su aplicabilidad diagn¨®stica se analizaron 130 muestras de cepillado cervical: 94 con citolog¨ªa normal, 24 LSIL y 12 HSIL. El ADN viral fue detectado en el 54% (70/130), de los cuales el 57% (40/70) pertenec¨ªa a HPV oncog¨¦nicos. El 55% (52/94) de las muestras con citolog¨ªa normal, fue concordante en el ensayo molecular. Un resultado doble-negativo (citolog¨ªa normal y ausencia de ADN de HPV oncog¨¦nico) indica mejor pron¨®stico contra futuras lesiones HSIL que tres resultados negativos consecutivos en la citolog¨ªa. El 45% (42/94) restante de las muestras con citolog¨ªa normal present¨® secuencias de HPV, detect¨¢ndose tipos oncog¨¦nicos en el 21% (20/94) de las mismas. Mujeres con citolog¨ªa normal que resulten positivas al ADN de HPV oncog¨¦nicos presentan un riesgo 100 veces mayor de desarrollar HSIL, respecto a las mujeres negativas para ambas determinaciones. Entre las muestras que presentaron LSIL, el 75% (18/24) fue positiva para HPV, tipific¨¢ndose HPV oncog¨¦nicos en el 42% (10/24). Todas las muestras HSIL que presentaron secuencias de HPV (83%; 10/12) correspondieron a tipos oncog¨¦nicos. La regresi¨®n de las lesiones siempre tiene lugar posteriormente a la erradicaci¨®n viral, lo cual podr¨ªa explicar el resultado negativo para HPV en 6 de las muestras LSIL y 2 HSIL. Adem¨¢s, el L1HPVPCR fue utilizado para demostrar la asociaci¨®n de HPV en muestras de tejidos embebidos en parafina de mucosa cervical. Este an¨¢lisis permiti¨® correlacionar la degradaci¨®n del oncosupresor h-Dlg por la oncoprote¨ªna E6 de HPV oncog¨¦nicos con los procesos de transformaci¨®n maligna en el trabajo publicado por nuestro grupo (Cavatorta et al, 2004). Estos resultados indican al L1HPVPCR como una herramienta de alta sensibilidad para la detecci¨®n precoz del c¨¢ncer cervical. Considerando la falta de acceso a los ensayos de detecci¨®n y tipificaci¨®n de HPV comerciales, el ensayo aqu¨ª presentado constituye un instrumento de importancia para asegurar la calidad y continuidad de los resultados, y permitir un seguimiento m¨¢s eficiente de las mujeres con riesgo de desarrollar c¨¢ncer cervical.

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