Análisis del estado físico del ADN de papillomavirus humano tipo 16 como marcador de progresión maligna

BERCOFF, M.; CHOUHY, DIEGO; GARDIOL, DANIELA; ADRIANA ANGELICA GIRI

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virología

Los Papillomavirus humanos (HPV) de alto riesgo, tales como el HPV-16, son agentes causantes de lesiones que pueden progresar a malignidad y se encuentran asociados con carcinoma de cuello de útero de carácter invasor. El genoma de HPV-16 es mantenido en forma episomal en lesiones benignas y de bajo grado, mientras que en lesiones de alto grado y en carcinomas cervicales se encuentra principalmente integrado al genoma celular. La linearización del genoma viral, proceso previo a la integración, ocurre por la ruptura de la región E1/E2 resultando en la interrupción de esos marcos de lectura y pérdida de la expresión de los productos génicos correspondientes. E2 codifica para una proteína que regula la transcripción viral y esta interrupción libera el promotor de los oncogenes virales E6 y E7 de la acción inhibitoria de E2. Las oncoproteínas E6 y E7, interfieren con las funciones de proteínas regulatorias celulares con el consecuente desequilibrio en el control de la proliferación, que conduce a la transformación celular. En base a estas consideraciones, la integración del ADN de HPV en el genoma celular es considerada un evento clave en la progresión a cáncer cervical y por ello el grado de integración ha sido propuesto como un marcador de pronóstico de progresión maligna. El objetivo de este trabajo es el análisis del estado físico del ADN de HPV-16 como marcador de progresión maligna. Para ello desarrollamos y optimizamos un ensayo basado en PCR y detección colorimétrica para medir el cociente E2/E6 de HPV-16 y determinar si el ADN viral se encuentra episomal (E2/E6 = 1), integrado (E2/E6 = 0) o en formas mixtas (0 << E2/E6 << 1). El ensayo aquí presentado incluye las siguientes etapas: i) co-amplificación por PCR de fragmentos de 264 pb de E2 y de 207 bp de E6, utilizando los cebadores antisentido biotinilados, ii) hibridación en fase líquida de los productos amplificados con sondas fluoresceinadas específicas para cada fragmento génico, iii) captura de los híbridos en microplaca revestida con estreptavidina, iv) detección con anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa y un cromógeno, v) lectura del color en un lector microplacas, y vi) cálculo del cociente E2/E6 a partir de los valores de densidad óptica obtenidos con cada sonda al finalizar la reacción colorimétrica. Se optimizó esta PCR multiplex con el plásmido pW12 que contiene el genoma completo de HPV-16. Los amplicones se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y detección colorimétrica. Se obtuvieron condiciones de PCR en la cuales los valores de absorbancia para E2 y E6 fueron similares en presencia de ADN de HPV-16 episomal (E2/E6 = 1). La sensibilidad analítica del ensayo para cada fragmento génico fue de 100 copias/reacción. En una segunda etapa se evaluará el valor pronóstico del cociente E2/E6 en la progresión maligna en muestras de pacientes infectadas con HPV-16 y que presenten lesiones cervicales de distinto grado de severidad. Este ensayo permitirá correlacionar el grado de severidad de las lesiones con el nivel de integración viral y su contribución en los procesos de progresión maligna asociados a HPV.  i) co-amplificación por PCR de fragmentos de 264 pb de E2 y de 207 bp de E6, utilizando los cebadores antisentido biotinilados, ii) hibridación en fase líquida de los productos amplificados con sondas fluoresceinadas específicas para cada fragmento génico, iii) captura de los híbridos en microplaca revestida con estreptavidina, iv) detección con anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa y un cromógeno, v) lectura del color en un lector microplacas, y vi) cálculo del cociente E2/E6 a partir de los valores de densidad óptica obtenidos con cada sonda al finalizar la reacción colorimétrica. Se optimizó esta PCR multiplex con el plásmido pW12 que contiene el genoma completo de HPV-16. Los amplicones se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y detección colorimétrica. Se obtuvieron condiciones de PCR en la cuales los valores de absorbancia para E2 y E6 fueron similares en presencia de ADN de HPV-16 episomal (E2/E6 = 1). La sensibilidad analítica del ensayo para cada fragmento génico fue de 100 copias/reacción. En una segunda etapa se evaluará el valor pronóstico del cociente E2/E6 en la progresión maligna en muestras de pacientes infectadas con HPV-16 y que presenten lesiones cervicales de distinto grado de severidad. Este ensayo permitirá correlacionar el grado de severidad de las lesiones con el nivel de integración viral y su contribución en los procesos de progresión maligna asociados a HPV.