Evaluación de aptámeros específicos contra la proteína de la nucleocápside (N) de Sars-CoV-2 para el desarrollo de un test rápido de detección de la infección.

GARCÍA REY, JULIETA; CERRI, AGUSTINA; BELLANDI, TOMÁS; CHOUHY, DIEGO -; BOLATTI, ELISA M; GIRI ADRIANA A

Rosario

Jornada; II Jornadas de Ciencia y Tecnología de la FBIOyF; 2023

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas

Introducción: Desde la identificación del coronavirus pandémico SARS-CoV-2 (1), se han realizado esfuerzos para desarrollar y producir pruebas diagnósticas que permitan detectar tempranamente la infección viral (Point-of-Care Testing: POCT) (2,3). La mayoría de estas pruebas para COVID-19 disponibles en el mercado son de origen extranjero y utilizan anticuerpos monoclonales (AcM). Los aptámeros son moléculas de ADN o ARN de una sola hebra con una estructura tridimensional específica que pueden unirse con alta afinidad y especificidad a una amplia gama de moléculas (4). Además, su producción requiere una infraestructura mucho más sencilla y económica que la necesaria para producir AcM. Aunque se han descrito aptámeros con potencial terapéutico y diagnóstico para el SARS-CoV-2 (5,6), actualmente existen pocos ensayos comerciales que los utilicen.En este trabajo proponemos la expresión y purificación de la proteína N recombinante de SARS-CoV-2 para evaluar la capacidad de unión de cinco aptámeros previamente reportados en bibliografía (7,8) que luego podrán ser utilizados en el futuro como sensores moleculares en técnicas cromatográficas para el desarrollo de un test rápido de detección de antígenos para el diagnóstico temprano de COVID-19.Resultados: La expresión de la proteína N y su dominio de unión a ARN (RBD) fue realizada a partir de plásmidos sintéticos conteniendo las secuencias de la variante Ómicron de SARS-COV-2 fusionadas a la secuencia de la proteína GST. Se optimizó un protocolo de expresión aplicado previamente en nuestro laboratorio utilizando 12 condiciones de inducción (0.5 y 1 mM de IPTG incubados por 2 hs, 4 hs y overnight, a dos temperaturas diferentes: 30°C y 37°C) hasta obtener concentraciones de aproximadamente 10 mg/ml. La purificación de las proteínas se realizó con esferas de sefarosa de 34 μm de diámetro para medir la intensidad de fluorescencia del complejo Aptámero-Proteína utilizando citometría de flujo, para luego calcular la constante de disociación (Kd) como medida de afinidad de unión de cada aptámero. Se seleccionaron 2 aptámeros candidatos que presentaron los menores valores de Kd: A-61 (Kd=22.34 nM) y A-15 (Kd=20.8 nM). Para determinar si los aptámeros A-61 y A-15 poseían afinidad por diferentes regiones de proteína N se realizaron pruebas de competencia enfrentando las proteínas recombinantes (RBD o N) con concentraciones crecientes de uno de los aptámeros y manteniendo al otro en concentración saturante. Efectivamente se corroboró que el aptámero A-61 tenía afinidad al dominio RBD y el aptámero A-15 a una región diferente de la proteína N. Conclusiones: Los aptámeros seleccionados son candidatos adecuados para su aplicación en el desarrollo y puesta a punto de un test rápido de cromatografía lateral para el diagnóstico temprano de SARS-CoV-2. Los resultados derivados de este proyecto sientan las bases para el desarrollo biotecnológico de un test POCT regional con aplicaciones futuras en el diagnóstico de SARS-CoV-2 y otras infecciones virales.Referencias:1) Zhou, P. et al. Nature 2020, 579, 270-273. 2) Vogels, C. B. F. et al. Nat Microbiol. 2020, 5, 1299-1305. 3) Rai, P., et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2021, 105, 441–455. 4) Jayasena S. D. Clin Chem. 1999, 45, 1628-50. 5) Chen, Z., et al. Virol. Sin. 2020, 35, 351–354. 6) Acquah, C., et. al. Cell. Mol. Bioeng. 2021, 14, 209–221. 7) Zhang, L. et al. Chem. Commun. (Camb). 2020, 56, 10235–10238. 8) Kang, J. et al. Anal. Chem. 2021, 93, 992–1000.