BÚSQUEDA, CLONADO Y EXPRESIÓN DE UNA REDUCTASA DE C=C ACTIVADOS

ZOCCHI, SOFÍA B.; CECCOLI, ROMINA D.; BIANCHI, DARIO A.; RIAL, DANIELA V.

Rosario

Jornada; II Jornadas de Ciencia y Tecnología de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas , UNR; 2023

Secretaría de Ciencia y Tecnología de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la Universidad Nacional de Rosario

La búsqueda de nuevas formas de sintetizar sustancias químicas, alternativas a laspropuestas por la química tradicional, que cumplan con los principios de la química verde hallevado a la incorporación de biocatalizadores como enzimas, microorganismos o vegetales enrutas de síntesis química. Esto permite aprovechar la alta eficiencia, la exquisita selectividad yespecificidad de las reacciones enzimáticas y al mismo tiempo su compatibilidad con el medioambiente. El interés por los procesos sustentables ha impulsado al equipo de investigación a trabajar en el desarrollo de biocatalizadores con potencial aplicación en el campo de la síntesis química. Existe un grupo de enzimas conocidas como OYEs (Old Yellow Enzymes) que son capaces de llevar a cabo la reducción asimétrica de enlaces C=C activados por un grupo atrayente de electrones, como un aldehído o cetona. Las mismas son flavoenzimas dependientes de NAD(P)H y han sido aplicadas en la laboración de una gran variedad de compuestos, muchos de ellos interesantes para la industria farmacéutica. Con el fin de disponer de OYEs que puedan ser de utilidad para nuestras rutas biosintéticas y de contribuir al repertorio actual de biocatalizadores redox, se realizó por métodos bioinformáticos una búsqueda de secuencias bacterianas codificantes para este tipo de enzimas y se identificó la secuencia de una posible OYE en el genoma de Leptospira biflexa. La misma fue clonada en un vector de expresión y producida en Escherichia coli. De este modo, a partir de células de E. coli transformadas con el plásmido construido se obtuvo la proteína recombinante y su expresión soluble se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condicionesdesnaturalizantes. La actividad de la enzima fue evaluada mediante ensayos de biotransformación in vivo utilizando células enteras recombinantes en reposo como biocatalizador. Como control se utilizaron células de E. coli transformadas con el vector de expresión. Las reacciones fueron analizadas por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa. En las condiciones ensayadas, este biocatalizador fue capaz de reducir la cetona α,β-insaturada 1-fenil-1-hexen-3-ona, obteniéndose la cetona saturada correspondiente.