LA CADENA PEPTÍDICA DE LA HORMONA OREXIGÉNICA GHRELINA ES HIDROLIZADA EN PLASMA

LUFRANO, DANIELA; FITTIPALDI, ANTONELA; CASTROGIOVANNI, DANIEL; DE FRANCESCO, PABLO NICOLÁS; TREJO, SEBASTIAN; PERELLO, MARIO

Buenos Aires

Congreso; XXXII Congreso Argentino de Química; 2019

Asociación Argentina de Química

IntroducciónLa ghrelina (Ghr) es la única hormona peptídica con capacidad de estimular el apetito en sí mismo y también la preferencia por alimentos calóricos. En individuos sanos, los niveles plasmáticos de Ghr aumentan antes de una ingesta de alimentos programada y luego descienden hasta valores basales1. En personas con desórdenes del peso corporal, desde obesidad a anorexia nervosa, los niveles basales de Ghr están generalmente alterados. Esto sugiere un aporte a la fisiología de estos desórdenes y presupone un interés biomédico de la hormona. La Ghr es un péptido de 28 aminoácidos esterificado en la posición 3 (Ser3) con un ácido octanoico2. Los primeros cinco aminoácidos, incluido el grupo octanoilo, son indispensables para la unión de la hormona a su receptor específico mediante el cual desencadena sus actividades biológicas3,4. Si bien hay numerosos estudios sobre la hidrólisis del octanoilo5,6, la hidrólisis de la cadena peptídica de la Ghr por acción de proteasas ha sido escasamente explorada. Se ha descripto que un gran número de hormonas peptídicas son procesadas por proteasas dando lugar a péptidos más cortos cuyas actividades biológicas respecto a la de la hormona parental difieren de manera cuantitativa (actividad más fuerte o más débil) o cualitativa (actividad más específica, opuesta o incluso, completamente diferente). De este modo, el procesamiento proteolítico puede participar en la modulación de la actividad hormonal7. Conocer el procesamiento de una hormona y las proteasas involucradas en él, brindan un mejor entendimiento del rol de la hormona tanto en el estado fisiológico como en condiciones patológicas. En el presente trabajo nos propusimos estudiar la hidrólisis de la cadena peptídica de la Ghr por acción de proteasas plasmáticas.ResultadosPara cumplir con el objetivo propuesto, empleamos análogos de Ghr humana o murino (Ghr 1-19) modificados con isotiocianato de fluoresceína en el extremo C-terminal. Cada análogo fluorescente (F-Ghr) se incubó a 37 ºC con plasma de su misma especie. Las mezclas incubadas se analizaron luego por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas (Native-PAGE) con visualización de la fluorescencia bajo luz UV. La proteólisis de la F-Ghr en las digestiones, se evidenció por la presencia de bandas fluorescentes no observadas en los controles del ensayo. El patrón de bandas de la F-Ghr de ambas especies resultó coincidente, sugiriendo un procesamiento equivalente. A fin de conocer la identidad de los fragmentos producidos por digestión plasmática, las incubaciones se repitieron empleando Ghr sintética conteniendo la secuencia nativa y se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight). Los espectros obtenidos permitieron detectar seis péptidos originados por el corte de tres enlaces internos de la secuencia de la Ghr (13-14; 14-15; 15-16) tanto humana como de ratón. Con el objetivo de analizar si el hígado es una potencial fuente de proteasas plasmáticas que actúan sobre la hormona, la Ghr humana se agregó al medio de cultivo de células de hepatocarcinoma humano (HepG2) crecidas en placa. Tras la incubación a 37 ºC en atmósfera de CO2 (5%), el análisis por MALDI-TOF MS mostró la presencia de los mismos fragmentos derivados de la Ghr que fueron observados en las digestiones con plasma. Para estudiar si las proteasas procesadoras de la Ghr son secretadas al medio, un cultivo de células HepG2 se centrifugó y el sobrenadante se empleó como fuente de proteasas en las digestiones de la F-Ghr humana. Luego, la mezcla incubada se sometió a Native- PAGE, junto a un control negativo y a una digestión plasmática de la F-Ghr como control positivo. Este ensayo mostró actividad proteolítica en el sobrenadante del medio de cultivo con un patrón de bandas coincidente con el obtenido en las digestiones plasmáticas. ConclusionesLos resultados obtenidos indican que la cadena aminoacídica de Ghr es hidrolizada por proteasas del plasma que originan péptidos menores que contienen la porción activa de la hormona. De acuerdo a los péptidos identificados, la región comprendida entre los aminoácidos 13 y 16 de la secuencia de Ghr representa una ?zona diana? para la acción de dichas proteasas Los resultados obtenidos con la línea celular HepG2, sugieren la participación del hígado en el procesamiento de la Ghr al sintetizar proteasas que actúan sobre ella. La información proporcionada en este trabajo puede ayudar a mejorar los kits de cuantificación de Ghr disponibles comercialmente, los cuales al no contemplar la posible existencia de formas truncadas de la Ghr muestran discrepancias en las mediciones y podrían subestimar los niveles de hormona activa. También esta información puede sentar las bases en la búsqueda de marcadores bioquímicos para desórdenes metabólicos.