Método de determinación de acumulación lisosomal de Gb3 empleando citometría de flujo: posible herramienta diagnóstica para mujeres heterocigotas con Enfermedad de Fabry

DE FRANCESCO P N; CECI R; MUCCI J M; ROZENFELD P A

Mar del Plata

Congreso; LVI Reunión Científica Anual SAIC - Reunión Científica Anual SAFIS 2011 - Reunión Científica Anual AACYTAL 2011; 2011

SAIC - SAFIS - AACYTAL

La Enfermedad de Fabry (EF) es un desorden genético ligado al X, causado por la deficiencia en la enzima α-galactosidasa A (GLA), que conduce a la acumulación lisosomal de globotriaosilceramida (Gb3). En varones, la demostración de la deficiencia enzimática es el diagnóstico confirmatorio. Para el diagnóstico de heterocigotas, el dosaje enzimático no es de utilidad ya que pueden obtenerse valores reducidos a normales. En aquellos casos donde el caso índice sospechoso es una mujer, el diagnóstico se confirma mediante la secuenciación completa del gen GLA, que codifica para dicha enzima. Dicho estudio puede ser no concluyente dado que un pequeño porcentaje de las mutaciones en EF, tales como inversiones, duplicaciones, o mutaciones intrónicas o en el promotor, son indetectables mediante el método analítico utilizado. El objetivo de este trabajo es proponer un método de diagnóstico basado en la detección de la acumulación de Gb3, empleando citometría de flujo, y evaluar su utilidad para el diagnóstico de heterocigotas. Se cultivaron esplenocitos de ratones wild type (RWT) y knock-out para GLA (RF) o células mononucleares de individuos controles incubadas con 800 µM de DGJ, un inhibidor de GLA, durante 18 hs en presencia de un análogo fluorescente del Gb3, NBD-Gb3. Luego se lavaron, se incubaron con medio fresco por diferentes tiempos (0, 24, 48 y 72 hs), y se analizaron por citometría de flujo. Tanto en los esplenocitos de RF como en las PBMC expuestas a DJG se detectó la acumulación de Gb3 evaluado como un aumento de fluorescencia, en comparación con los RWT y PBMC no tratada, respectivamente. La diferencia en fluorescencia fue mayor a las 24 hs. luego del lavado. Este método permitiría detectar la población celular con GLA deficiente del total de las PBMC de mujeres con sospecha de Fabry, separarla mediante cell-sorting, y facilitar el estudio genético a partir del análisis del alelo mutado haciendo uso de la secuenciación del ARNm.