Proteín fosfatasas y proteín quinasas están involucradas en el sensado de hidratos de carbono como respuesta a situaciones ambientales

MARTÍNEZ-NOËL G; TOGNETTI J; SALERNO G; PONTIS H

Buenos Aires, Argentina

Simposio; REDBIO-FAO; 2002

REDBIO-FAO

Las plantas producen azúcares durante la fotosíntesis en los tejidos verdes, siendo la sacarosa (sac) el más comúnmente almacenado y exportado hacia tejidos heterotróficos. En adición a estas funciones, sac es una importante molécula señal que regula la expresión de una gran variedad de genes (Smeekens 2000). Hasta el presente se conoce muy poco acerca de los pasos involucrados en el señalamiento, si bien se reconoce la posible implicancia de mecanismos de fosforilación/defosforilación de proteínas intermediarias de la transmisión del mensaje. En este trabajo se estudian el mecanismo de inducción por sac de las enzimas involucradas en la síntesis de fructanos, polímeros de fructosa acumulados por numerosas plantas superiores en respuesta a bajas temperaturas y sequía. sac) el más comúnmente almacenado y exportado hacia tejidos heterotróficos. En adición a estas funciones, sac es una importante molécula señal que regula la expresión de una gran variedad de genes (Smeekens 2000). Hasta el presente se conoce muy poco acerca de los pasos involucrados en el señalamiento, si bien se reconoce la posible implicancia de mecanismos de fosforilación/defosforilación de proteínas intermediarias de la transmisión del mensaje. En este trabajo se estudian el mecanismo de inducción por sac de las enzimas involucradas en la síntesis de fructanos, polímeros de fructosa acumulados por numerosas plantas superiores en respuesta a bajas temperaturas y sequía. Metodología. Se utilizaron plántulas de trigo cv. Pincén cultivadas en condiciones óptimas hasta el estadio de primera hoja expandida. Las láminas foliares escindidas fueron tratadas con soluciones de azúcares y/o con inhibidores específicos de proteín quinasas (PK), proteín fosfatasas (PP) y quelantes de calcio en oscuridad a distintos tiempos. La actividad de las enzimas responsables de la síntesis de fructanos se midió según Puebla et al (1999). Para la realización de Northern blots, y para cuantificar las actividades de PK y PP se emplearon protocolos standard. Se utilizaron plántulas de trigo cv. Pincén cultivadas en condiciones óptimas hasta el estadio de primera hoja expandida. Las láminas foliares escindidas fueron tratadas con soluciones de azúcares y/o con inhibidores específicos de proteín quinasas (PK), proteín fosfatasas (PP) y quelantes de calcio en oscuridad a distintos tiempos. La actividad de las enzimas responsables de la síntesis de fructanos se midió según Puebla et al (1999). Para la realización de Northern blots, y para cuantificar las actividades de PK y PP se emplearon protocolos standard. Resultados. En nuestro laboratorio se ha demostrado que sac y otros azúcares metabolizables inducen la enzima sucrose: fructan 6-fructosyl transferase (6-SFT) a nivel de transcripción en hojas de trigo, dando como resultado la aparición y acumulación de fructanos (Martínez Noël et al 2001). La aplicación de inhibidores de Ser/Thr PK como la estaurosporina y el W7 bloqueó la inducción de la 6-SFT mediada por sac, al igual que los quelantes de Ca+2 EGTA y BAPTA, sugiriendo que PK dependientes de calcio actuarían en el señalamiento. De igual forma el inhibidor de Ser/Thr PP, ácido okadaico, inhibió la inducción de la 6-SFT por sac con lo cual las PP también estarían involucradas en la señal por azúcares. En consecuencia, se midieron las actividades CDPK y PP2A. La actividad CDPK en extractos totales aumentó con el tratamiento de sac en tiempos muy cortos (entre 15 min y 1 h) mientras que se observó una disminución de la actividad a tiempos más largos. Sin embargo, la actividad de PP2A en extractos totales no aumentó con el tratamiento con sac pero igualmente se detectó una disminución a tiempos largos (luego de 6 h). El estudio ya iniciado de las respuestas de PK y PP individuales a sac permitirá profundizar en el conocimiento del mecanismo de señalamiento que lleva a la inducción de 6-SFT y, en general, a diferentes respuestas de la planta ante cambios en los niveles de azúcares. En nuestro laboratorio se ha demostrado que sac y otros azúcares metabolizables inducen la enzima sucrose: fructan 6-fructosyl transferase (6-SFT) a nivel de transcripción en hojas de trigo, dando como resultado la aparición y acumulación de fructanos (Martínez Noël et al 2001). La aplicación de inhibidores de Ser/Thr PK como la estaurosporina y el W7 bloqueó la inducción de la 6-SFT mediada por sac, al igual que los quelantes de Ca+2 EGTA y BAPTA, sugiriendo que PK dependientes de calcio actuarían en el señalamiento. De igual forma el inhibidor de Ser/Thr PP, ácido okadaico, inhibió la inducción de la 6-SFT por sac con lo cual las PP también estarían involucradas en la señal por azúcares. En consecuencia, se midieron las actividades CDPK y PP2A. La actividad CDPK en extractos totales aumentó con el tratamiento de sac en tiempos muy cortos (entre 15 min y 1 h) mientras que se observó una disminución de la actividad a tiempos más largos. Sin embargo, la actividad de PP2A en extractos totales no aumentó con el tratamiento con sac pero igualmente se detectó una disminución a tiempos largos (luego de 6 h). El estudio ya iniciado de las respuestas de PK y PP individuales a sac permitirá profundizar en el conocimiento del mecanismo de señalamiento que lleva a la inducción de 6-SFT y, en general, a diferentes respuestas de la planta ante cambios en los niveles de azúcares. Conclusiones. Los resultados presentados sugieren que la sacarosa determina alteraciones en la expresión génica a través de un mecanismo de señalamiento mediado por Ca2+, calmodulina, proteín quinasas y proteín fosfatasas. La profundización de los estudios sobre señalamiento por azúcares permitirá una mejor comprensión de las respuestas de las plantas al ambiente, y su eventual empleo con fines de mejoramiento. Los resultados presentados sugieren que la sacarosa determina alteraciones en la expresión génica a través de un mecanismo de señalamiento mediado por Ca2+, calmodulina, proteín quinasas y proteín fosfatasas. La profundización de los estudios sobre señalamiento por azúcares permitirá una mejor comprensión de las respuestas de las plantas al ambiente, y su eventual empleo con fines de mejoramiento. Referencias Smeekens S. 2000. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 49-81. Puebla A. Battaglia M Salerno G Pontis H. 1999. Plant Physiol. Biochem. 37: 699-702. Martínez Noël G. Tognetti J Pontis H. 2001. Planta 213: 640-646. Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 49-81. Puebla A. Battaglia M Salerno G Pontis H. 1999. Plant Physiol. Biochem. 37: 699-702. Martínez Noël G. Tognetti J Pontis H. 2001. Planta 213: 640-646. Plant Physiol. Biochem. 37: 699-702. Martínez Noël G. Tognetti J Pontis H. 2001. Planta 213: 640-646. Planta 213: 640-646.