Identificación y análisis de la secuencia promotora de RAC3

ALVARADO C; MARTINEZ NOEL G; MICENMACHER S; FERNANDEZ-LARROSA P; RUIZ-GRECCO M; RUBIO M; COSTAS M

Jornada; IX Jornadas Científicas del IDIM; 2010

Los coactivadores son proteínas que interaccionan con determinados factores de transcripción aumentando la expresión de sus genes blanco. En particular, RAC3 hallado en un principio como coactivador de receptores nucleares, es también coactivador de NF-kB como hemos demostrado en trabajos publicados por nuestro laboratorio y de muchos otros factores de transcripción como E2F y STAT6. RAC3 está sobrexpresado en tumores hormono-dependientes e independientes y contribuye a su desarrollo. Por ello, se procedió a evaluar las secuencias regulatorias que modulan la expresión del gen que codifica para RAC3 mediante el análisis bioinformático de su promotor. El gen de RAC3 de 155kb, se enuentra en el cromosoma 20 del genoma humano entre las posiciones 16326949-16481709 y codifica un transcripto de 7935pb. Se examinaron los sitios putativos de unión a factores de transcripción de una secuencia nucleotídica de 5kb (zona río arriba del gen y parte de la zona no-codificante) con los programas disponibles en Internet (AliBaba2.1, ConSite y Genomatix). Se identificaron sitios consenso de unión a factores de transcripción p53, GR, PR, NF-kB y Snail sugiriendo que la expresión de RAC3 podría estar afectada por vías desreguladas en tumores como la vía mTOR y/o en las vías en las que RAC3 interviene.Además, se analizaron las zonas regulatorias del promotor RAC3 conservadas con otros mamíferos (panda, rata, ratón, perro, vaca, zarigüeya). Encontramos tres regiones altamente conservadas evolutivamente en la región de 5kb del promotor (ECR1-ECR2-ECR3) (ECR Browser). ECR1 se encuentra en la región no codificante y ECR2 y ECR3 a -5 y -4000pb respectivamente. Interesantemente, ECR1 y ECR2 se encuentran conservados entre todos los organismos analizados. Identificamos etiquetas blanco para NF-kB en ECR1 y ECR3 y para Snail en ECR2, remarcando la importancia de estos sitios en la regulación de RAC3.Con el objetivo de estudiar si la vía mTOR, implicada en el crecimiento y proliferación celular, estaría involucrada en la expresión de RAC3 se evaluó la actividad promotora de dicho gen. Se realizaron ensayos reporteros con un fragmento de 1kb del promotor de RAC3 río arriba del gen de la luciferasa. Se observó un 20% menos de actividad en las células no tumorales HEK293 tratadas con Rapamicina 100 nM (inhibidor específico de la vía mTOR) respecto a las sin tratar (p<0.001). Resultados preliminares, muestran que el efecto de la droga bajaría los niveles proteícos de RAC3, en distintas líneas tumorales y no tumorales. Conclusiones La vía mTOR participaría entre otras en la regulación génica de RAC3 aunque se debe dilucidar cuales de los factores predichos actúan específicamente.