OXIDACIÓN FOTOSENSIBILIZADA DE ADUCTOS DE ROSA DE BENGALA CON ALBÚMINA SÉRICA BOVINA

ARGAÑARAZ, NATALIA M.; ESPECHE TURBAY, B; REY, VALENTINA; BORSARELLI, CLAUDIO D.

Encuentro; Séptimo Encuentro Nacional de Investigadores en Temas Relacionados con Sustancias Peroxídicas ?Dr. Lázaro Cafferata? (7º ENISP); 2012

El oxígeno molecular (3O2) es necesario para la vida, pero en determinadas condiciones de estrés a nivel celular puede generar un desbalance en la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO), como anión superóxido (O2?-), peróxido de hidrógeno (H2O2), y oxígeno singulete molecular (1O2), capaces de reaccionar y modificar oxidativamente a biomoléculas funcionales (lípidos, ADN y proteínas), y consecuentemente producir daño y/o muerte celular. Actualmente existe un gran interés en el mecanismo y en las consecuencias biológicas del daño ocasionado por especies radicalarias y no radicalarias sobre las macromoléculas, como las proteínas.[i] En particular, la oxidación de proteínas resulta en pérdidas severas de la funcionalidad biológica debido a cambios estructurales y/o conformacionales de la proteína nativa, por ejemplo alteración de la susceptibilidad a la proteólisis, disminución de la actividad enzimática, modificación de los residuos de aminoácidos, entrecruzamiento intra- o intermolecular, etc. En particular, el 1O2 se genera en sistemas biológicos tanto por procesos endógenos (reacciones enzimáticas y bioquímicas) como así también por estímulos exógenos, tales como exposición a la luz UV-visible de moléculas sensibilizadores (ej. porfirinas, vitamina B2, co-factores enzimáticos, moléculas de colorantes, etc).[ii] En el caso de la generación fotosensibilizada de 1O2, hay que considerar además que las proteínas presentan diversos sitios con propiedades locales apropiadas para la interacción y asociación de moléculas sensibilizadoras. Este fenómeno, puede modificar las rutas fotofísicas y fotoquímicas del sensibilizador, y por ende el mecanismo de foto-oxidación de la macromolécula.[iii]  Por tanto, existe un marcado interés en analizar tanto la interacción sensibilizador-proteína como el mecanismo de fotosensibilización de los aductos formados. Objetivos En este trabajo hemos estudiado el aducto formado entre albúmina sérica bovina (BSA) y el colorante xanténico Rosa de Bengala (RB), y caracterizado la oxidación fotoinducida de BSA en función de la relación molar colorante/proteína, mediante la utilización de espectroscopía de absorción UV-Vis y de fluorescencia, como también mediante técnicas analíticas y bioquímicas. Resultados La asociación de la RB con BSA se caracterizó mediante técnicas de absorción y fluorescencia en soluciones de buffer TRIS-HCl 20 mM a pH 7,4. La respuesta espectral del colorante en función de la concentración de proteína indicó que RB se asocia fuertemente a la proteína con una constante de asociación KA =0,5 mM-1, y  que el colorante se incorpora a un sitio de la proteína cuyas propiedades son menos polares que el  buffer de la solución. La irradiación con luz verde (560 ± 30 nm) de soluciones acuosas saturadas con aire del aducto RB-BSA en relaciones molares de RB (10 mM fija):BSA 1:1, 1:5, 1:10, mostraron cambios espectrales de absorción y fluorescencia de la proteína, que sugieren la formación progresiva de productos de oxidación de Trp1, y otros aminoácidos oxidables como Met, His, Cys y Tyr, confirmado por el consumo de O2 disuelto y el aumento concomitante de la concentración de grupos carbonilos formados.2 Estos productos de oxidación presentan un máximo de absorción entre 320-340 nm y máximo de fluorescencia » 410 nm. El agregado del ion azida N3-, un eficiente desactivador de 1O2,  redujo notoriamente estos cambios sugiriendo que este ERO es la especie intermediaria de la oxidación. Además, la modificación oxidativa de BSA, el consumo de oxígeno disuelto y la velocidad de blanqueo de RB fue mayor para el aducto 1:10 que 1:5 y 1:1, reflejando que la eficiencia de generación de 1O2 disminuye con la concentración intraproteica de colorante.   Por otra parte, la formación de peróxidos libres y consumo total de RB fue independiente de la relación colorante:proteína, sugiriendo la participación de O2?- en el blanqueo del colorante. Conclusiones Los resultados observados pueden ser explicados por la combinación de procesos de fotosensibilización del tipo I y II (es decir, transferencia de electrones y de energía, para formar O2?- y 1O2 como intermediarios ERO  respectivamente). La formación de productos de oxidación fluorescentes y el aumento en la concentración de carbonilos de los diferentes aductos son mediados por 1O2 (mecanismo Tipo II), mientras que la generación de  H2O2 libres y blanqueo de RB es intermediado por  O2?- (mecanismo tipo I). De esta manera podemos concluir que los procesos de fotosensibilización in vitro es una metodología apropiada para el estudio de  oxidación de proteínas e interpretar los cambios de estrés oxidativo llevados a cabo en las proteínas dentro de los medios biológicos. [i]. Finley, E.L.; Dillo, J; Crouch, R.K. and Schey K.L. (1998). Identification of trypthophan oxidation products in bovine α-crystallin. Prot. Sci. 7:2391-2397. 2. Sivester , A.; Timmins, S.; and Davies J. (1998) Protein hydroperoxides and carbonyl groups generated by porphyrin-induced photo-oxidation of Bovine Serum Albumin. Arch.  Biochem. Biophy. 350: 249-258. [iii]. Alarcón, E.; Edwards, A. M.; Garcia, A. M.; Muñoz, M.; Aspée, A.; Borsarelli, C. D. and Lissi, E. A. (2009). Photophysics and photochemistry of Zinc phthalocyanine/bovine serum albumin adducts. Photochem. Photobiol. Sci. 8: 255-263.