Optimización de PCR cuantitativa a partir de la predicción funcional de consorcios degradadores de hidrocarburos obtenidos de sedimento contaminado

ZULUETA M; MORELLI I. S.; MADUEÑO, L.

La Plata

Congreso; V Congreso Argentina de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2021

UNLP, Asociación Argentina de Microbiología

Un ensayo de qPCR optimizado es aquel que permite obtener resultados sólidos, reproducibles y estadísticamente significativos, siendo las pautas MIQE (Minimun Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR experiments) una guía actual de los procedimientos experimentales indispensables para lograrlo. La búsqueda y/o diseño de los primers para cuantificar genes de interés puede acotarse y ser específica de la muestra si conocemos los microorganismos allí presentes y sus potenciales funciones.El objetivo del trabajo fue seleccionar genes de degradación específicos de la muestra y optimizar su cuantificación en ensayos de qPCR, para utilizarlos en estrategias de biorremediación de sedimentos contaminados con hidrocarburos.La gran diversidad microbiana de los sedimentos dificulta la optimización de la qPCR cuando los genes de interés se encuentran en bajas copias. Por lo tanto, para facilitarla se utilizaron consorcios microbianos degradadores (P40F, P20F), obtenidos previamente mediante enriquecimientos sucesivos con fenantreno y sedimento del sitio afectado. Se extrajo ADN de los consorcios con EZNA Soil (OMEGA) Kit, se secuenció parcialmente el gen 16S rRNA (Illumina MiSeq), se realizó la asignación taxonómica (Microbiome Helper 16S) y predicción funcional de los metagenomas (PICRUSt). Utilizando las pautas MIQE (diferencias Ct0,95, Ct de las muestras en el rango lineal de la curva patrón, límite de cuantificación), se cuantificaron los genes degradadores aeróbicos 2,3 catecol dioxigenasa (xylE), alcano-1-monooxigenasa (alkB), 1,2 naftaleno dioxigenasa (ahdA1b) y el gen 16S rRNA para eubacterias. La asignación taxonómica mostró en P40F la presencia de los géneros Pseudomonas (37%), Dyella (27%), Rhodococcus (12%) y de la familia Alcaligeneaceae (10%) siendo los dos últimos, según la predicción funcional, los que más genes de degradación aportarían. P20F mostró la presencia en similares proporciones de los géneros Pseudomonas y Novosphingobium, observando un bajo número de genes de degradación predichos. Estos resultados se utilizaron en la selección de primers para amplificar alkb en Rhodococcus spp. y Pseudomonas spp., ahdA1b y xylE en Sphingomonas sensu latu., y 16S rRNA en eubacterias.P20F y P40F mostraron 6,5x105 y 6,2x106 de copias del gen 16S rRNA/ng ADN respectivamente. En concordancia con la predicción funcional, alkB fue cuantificado en mayor número de copias en P40F (6,24x104 copias/ngADN) que en P20F (4,8x103 copias/ngADN) (P0,05) y el gen ahdA1b se encontró por debajo del límite de cuantificación en los consorcios. Los resultados mostraron que la asignación taxonómica y predicción funcional, fueron herramientas útiles y confiables para la selección de genes funcionales. La optimización de la qPCR de genes degradadores permite utilizarlas en ensayos de biorremediación de sedimentos contaminados.