Obtención de líneas celulares transgénicas para el estudio genético y la manipulación de baculovirus

SANTIAGO HAASE; MARÍA GABRIELA LÓPEZ; MATIAS LUIS PIDRE; MARÍA LETICIA FERRELLI; ALICIA SCIOCCO CAP; VÍCTOR ROMANOWSKI

Buenos Aires

Exposici�n; XXXIII Reunión Científica Anual- Sociedad Argentina de Virología; 2013

La línea celular de lepidópteros Tn5B1-4 (conocida comercialmente como High FiveTM) es altamente susceptible a la infección por varios baculovirus y por lo general proporciona una producción de proteínas recombinantes superior en comparación con otras líneas celulares de insectos. Por esta razón, las células High Five se utilizan principalmente para la expresión de proteínas. La titulación de Baculovirus títulos es determinada generalmente en las líneas Sf-21 y Sf-9, ya que estas células tienen una morfología más regular y las placas producidas por AcMNPV (Autographa californica nucleopoliedrovirus) se distinguen fácilmente.Sin embargo, la absorción de baculovirus por las células High Five es mucho más eficiente que en Sf-9. En consecuencia, los títulos determinados en células High Five, expresados ​​como unidades formadoras de placa, son generalmente más altos y reflejan de forma más precisa el número de viriones infectivos. Para facilitar el proceso de titulación de baculovirus en High Five, se desarrollaron líneas celulares conteniendo genes reporteros bajo el control del promotores virales inducibles por infección. Asimismo, los baculovirus producen cuerpos de oclusión (OB) de un tamaño y una forma característica. Las interacciones específicas entre la proteína de la matriz de los cuerpos de oclusión y otros componentes virales que controlan la oclusión de los viriones y la morfología de los OBs aún no se comprenden con claridad. La poliedrina es una proteína muy conservada entre nucleopoliedrovirus (NPVs) presentando más  del 80% de identidad. A pesar de este alto nivel de similitud existen mecanismos no específicos de interacción entre el virión y la proteína de los cuerpos de oclusión y se ha planteado la hipótesis de que el crecimiento de la estructura del poliedro es iniciado por interacciones específicas entre las moléculas de poliedrina y la envoltura del virión. Considerando estos antecedentes, se desarrollaron líneas celulares que expresan la poliedrina de dos baculovirus, AcMNPV y AgMNPV (Anticarsia gemmatalis nucleopoliedrovirus), para la evaluación de la complementación funcional de este gen.Objetivos Generación de líneas celulares High Five establemente transformadas y evaluación de la expresión de los genes heterólogos insertados.  Titulación de baculovirus utilizando una línea celular que expresa el gen reportero eGFP. Establecimiento de un sistema semiautomatizado de titulación utilizando la línea celular mencionada anteriormente.   Estudio de la complementación funcional de la poliedrina de AcMNPV infectando una línea celular establemente transformada con diferentes baculovirus  con fenotipo de oclusión defectuoso (occ-).Materiales y métodos. Mediante métodos DNA recombinante estándar se construyeron vectores de expresión derivados del plásmido comercial pIB (InvitrogenTM) conteniendo los marcos de lectura (ORF) de los genes reporteros lacZ (β-galactosidasa) y egfp (proteína verde fluorescente) y de la poliedrina de AcMNPV y AgMNPV bajo el control del promotor viral tardío de poliedrina (ppolh). Los diferentes DNA plasmídicos obtenidos se transfectaron en células High Five. Posteriormente se seleccionó con el antibiótico Blasticidina y se aislaron los clones de células resistentes mediante el método de dilución terminal. A continuación se infectaron las distintas líneas celulares con diferentes baculovirus y se  caracterizó la expresión de las proteínas heterólogas. La línea celular que expresa GFP fue sembrada en una placa de 96 wells e infectada con diluciones seriadas de un virus de título conocido. La placa de 96 wells fue colocada en un espectrofotómetro bajo la excitación de luz ultravioleta y el título viral fue determinado y comparado. Las líneas celulares que expresan la poliedrina de AcMNPV y AgMNPV fueron infectadas con virus deficientes en poliedrina y se evaluó la aparición de cuerpos de oclusión. Los cuerpos de oclusión obtenidos se utilizaron luego para infectar larvas susceptibles. ResultadosSe logró generar líneas celulares establemente transformadas con genes de interés bajo un pormotor inducible por la infección viral. La línea celular que expresa el reportero GFP fue utilizada para establecer un método de titulación semiautomatizado que aprovecha el uso del espectrofotómetro para la lectura de placas de células. Las líneas celulares que expresan poliedrina de AcMNPV y AgMNPV se utilizaron para demostrar la complementación funcional de este gen. Nuestros resultados demuestran que la poliedrina de AgMNPV puede empaquetar viriones de AcMNPV y se observó que los cuerpos de oclusión generados son infectivos al ser inoculados por vía oral a larvas suceptibles. ConclusionesLa generación de líneas celulares demuestra ser una alternativa conveniente para el análisis de genes de virales. Con este sistema, se logró demostrar la complementación funcional de la poliedrina entre dos nucleopoliedrovirus, AgMNPV y AcMNPV. Además, la generación de poliedros ocluidos en líneas celulares empaquetadoras puede ser útil para la generación de baculovirus con capacidad de dispersión autolimitada. Finalmente, se estableció un sistema para la titulación sencilla de baculovirus, que posee la ventaja de determinar la concentración de unidades infecciosas.