Generación de una línea celular transgénica que expresa el gen esencial 1629 del baculovirus de Anticarsia gemmatalis con proyección al desarrollo de un sistema de recombinación de alta eficiencia

MARÍA LAURA FABRE; SANTIAGO HAASE; MARÍA LETICIA FERRELLI; MATIAS LUIS PIDRE; VÍCTOR ROMANOWSKI

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología II Congreso Latinoamericano de Virología IV Simposio de Virología Clínica II Simposio de Virología Veterinaria ?Dr . José L. La Torre?; 2015

p { margin-bottom: 0.25cm; line-height: 120%; }Elvirus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV)ha sido utilizado con éxito en paises con climas cálidos para elcontrol biológico de la oruga de las leguminosas, una plaga que ocasionapérdidas en el cultivo de soja y otras leguminosas. Sin embargo,su velocidad de acción lenta en climas templados limita su aplicaciónen otros países como Argentina. Una herramienta que permiteel mejoramiento de las propiedades insecticidas de los baculovirusconsiste en la ingeniería genética de sus genomas, usualmentebasada en la recombinación homóloga entre el virus y un vectorde transferencia apropiado. La frecuencia de recombinación es muybaja y por eso la proporción de virus recombinantes suele ser menoral 1%, el aislamiento de virus modificados resulta muy laborioso ydemanda mucho tiempo. Por esto, se han desarrollado sistemas de selecciónque permiten aumentar la proporción de virus recombinantes,algunos de ellos basados en la generación de virus deficientesen genes esenciales, incapaces de subsistir en células infectadas,que recuperan el gen eliminado al recombinar con un vector detransferencia. Para comenzar a abordar la generación de un sistema derecombinación de alta eficiencia para AgMNPV, se desarrolló una líneacelular que permitirá el mantenimiento de un virus AgMNPV deficienteen el gen esencial 1629.Seconstruyó un vector plasmídico para la generación de la líneacelular transgénicaque exprese constitutivamente el gen 1629, basado en el vectorde selección pIB/V5-His. Se transfectaron células High Five con estaconstrucción y se aislaron clones de células transgénicas medianteunprocedimiento de dilución terminal. La línea celular obtenida fue infectadacon un bácmido de AcMNPV (virus de la poliedrosis múltiple deAutographa califormica deficiente en el gen 1629. Finalmente, se evaluóla producción de virus brotantes del bácmido en estas células infectandouna línea celular (XXL-GFP) que posee un gen indicador bajo unpromotor viral tardío.Sedesarrolló la línea celular High Five-1629Ag que permite expresa elgen1629 constitutivamente. Para analizar la complementación funcionalde la línea transgénica, se infectaron, en una línea tituladora (XXL-GFP),los sobrenadantes de las células High Five-1629Ag y High Five,previamente transfectadas con el bácmido. Se observó fluorescenciasólo con el sobrenadante de High Five-1629Ag,indicando que el bácmido sólo puede formar viriones brotantesfuncionales en estascélulas. Para la eliminar parte del gen 1629 de AgMNPV secotransfectó el DNA genómico de este virus con un plásmido detransferencia. La recombinación homóloga entre ambos se verificópor la expresión de un gen indicador del vector (GFP).Lalínea celular transgénica generada permitió la complementación deunbácmido deficiente en el gen 1629 y podría utilizarse asímismopara elmantenimiento de un AgMNPV con una deleción en este gen.