EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DEL VIRUS JUNIN: HERRAMIENTAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE EN EL HUESPED

MARÍA MAGDALENA SÁNCHEZ VALLDUVÍ; MATIAS LUIS PIDRE; SANTIAGO HAASE; AGUSTÍN URE; RICARDO MARTÍN GÓMEZ; VÍCTOR ROMANOWSKI

Congreso; Congreso Argentino de Virología 2011; 2011

*Autores que contribuyen por igual. El virus Junín (JUNV) es el causante de la fiebre hemorrágica argentina (FHA), una enfermedad emergente, resultado de la actividad productiva que favoreció el contacto del hombre con roedores silvestres en nuevos ambientes ecológicos. En nuestro grupo de investigación hemos clonado los marcos de lectura abiertos de diferentes genes estructurales del virus (N, Z y GPC), con el fin de expresarlos en un sistema heterólogo para contar con inmunógenos para el estudio detallado de la respuesta inmune en los pacientes de FHA y en roedores. Se utilizó el sistema de expresión basado en baculovirus y células de insecto con el fin de obtener las proteínas estructurales de JUNV y evaluar su reactividad frente a diversos sueros de pacientes. El gen N de JUNV fue clonado en los vectores de transferencia pAcUW2B y pAcRP25. Estos vectores de transferencia fueron empleados para obtener los baculovirus recombinantes AcJUN-N+ (polh+) y AcJUN-N (polh-). Los marcos de lectura abiertos (ORFs) de Z, GPC y una variante del precursor de la glicoproteína de superficie (GPCfur) se clonaron en el plásmido de transferencia pBacPAK9. El gen GPCfur incluye una modificación (adicionada por SOE PCR) que codifica para la secuencia de aminoácidos reconocida por la proteasa furina para facilitar el procesamiento del polipéptido en la vía secretoria de las células de lepidópteros. El DNA de los plásmidos construidos se cotransfectó con el DNA del bácmido bGOZA en células de insecto para generar baculovirus recombinantes. En este sistema se suprime el background de virus parental y consiste en un genoma modificado del baculovirus AcMNPV, capaz de replicar en E. coli pero inviable en células de insecto porque carece de una porción de un gen esencial (ORF 1629) y que se recupera al producirse la recombinación homóloga con el plásmido pBacPAK9. La recombinación homóloga entre los diferentes pares de DNAs resultó en cada caso en un virus recombinante que recuperó el ORF 1629 intacto e incorporó el gen de interés. Se confirmó la expresión de las proteínas heterólogas mediante SDS-PAGE. Posteriormente, se analizó la reactividad de las proteínas frente a sueros de pacientes infectados con JUNV o LCMV (provistos por el centro de referencia del INEVH) mediante un ensayo de Western blot, evaluando diluciones de los anticuerpos primarios y secundarios con el fin de garantizar la máxima relación señal/background. La disponibilidad de las proteínas recombinantes evita el uso de virus infectivo en la preparación de antígenos para enzimoinmunoensayos tanto para los estudios de confirmación etiológica en pacientes como en programas de vigilancia. Asimismo, la evaluación de las reactividades de los sueros frente a las diferentes proteínas estructurales del virus provee información útil para el futuro desarrollo de vacunas de nueva generación.