Optimización de las condiciones de reacción de Fenilalanina amonio liasa empleando un hidrolizado de proteína como substrato modelo

CASTAÑEDA, M. TERESITA; ADACHI, OSAO; HOURS, ROQUE A.

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. Universidad Nacional del Litoral

Introducción L-Fenilalanina amonio liasa (PAL, EC 4.3.1.25) cataliza la bioconversión de L-fenilalanina (L-Phe) en ácido t-cinámico (t-CA) y amoníaco. Esta enzima fue descripta por primera vez in plantas superiores, donde su función se la asociaba a mecanismos de defensa. Unos años después pudo ser aislada en algunos microorganismos, en especial en levaduras del género Rhodotorula. Dentro de este género, Rhodosporidium toruloides NBRC 0559 fue la cepa que evidenció mayor actividad PAL cuando fue cultivada en un medio conteniendo L-fenilalanina como inductor. PAL ha sido producida, purificada y caracterizada en una amplia gama de plantas y algunos microorganismos. En los últimos años, PAL ha despertado interés por su potencial uso en el tratamiento de la fenilcetonuria (PKU), enfermedad congénita caracterizada por la deficiencia de la enzima metabólica L-fenilalanina hidroxilasa (PAH, EC. 1.14.16.1), la cual cataliza la conversión de fenilalanina en tirosina. En los pacientes con PKU, la fenilalanina se acumula en el torrente sanguíneo produciendo graves trastornos a nivel del sistema nervioso central. Actualmente, el único tratamiento posible consiste en la ingesta de alimentos con escaso o nulo contenido de fenilalanina. Estudios anteriores han determinado cuales son los parámetros óptimos para la reacción de PAL purificada con L-fenilalanina como substrato. En general estos parámetros dependen esencialmente del origen de la enzima, ya sea microorganismo o planta. El objetivo de este trabajo es determinar los parámetros óptimos de reacción de PAL con un substrato complejo empleado como modelo, en este caso, un hidrolizado ácido de caseína. Metodología PAL producida a partir de R. toruloides fue aislada y parcialmente purificada, siguiendo los lineamientos de Adachi y col. (1990). Dicha enzima fue empleada en el tratamiento de un hidrolizado ácido de caseína (CAH, OXOID L41, AN/TN = 64%, L-Phe ~ 2,28 % p/p), con la finalidad de reducir el contenido de L-fenilalanina. Las condiciones de reacción fueron optimizadas en términos de: concentración de substrato (0-50 g/l), concentración de enzima (0 - 280 mU/ml), pH (7 - 9) y temperatura (30 - 70ºC), mediante el empleo de sucesivas superficies respuesta, por medio del diseño hexagonal de Doehlert. Para describir la respuesta observada, se empleó un modelo cuadrático, cuyos coeficientes fueron calculados mediante ANOVA. Z= β_0+∑_(i=1)^k▒〖β_(i ) X_i+〗 ∑_(i=1)^k▒〖β_ii X_i^2+∑_(i=1)^k▒∑_(i=1)^L▒〖β_ij X_i X_j 〗〗 Una vez que los parámetros fueron optimizados, se determinó la cinética de reacción de la enzima con CAH como substrato, bajo dichas condiciones. Con la finalidad de medir la actividad enzimática empleando un sustrato complejo, se desarrolló una metodología alternativa al método tradicional. Para ello, la muestra es disuelta en buffer Tris-HCl (0,1 M, pH 8,0) con 5 mM 2NaEDTA para luego ser tratada con la enzima a 30°C. La reacción es detenida a diferentes tiempos mediante el agregado de un volumen igual al 10 % (v/v) de una solución concentrada de ácido tricloroacético (TCA, 20 % p/v). Seguidamente la muestra es centrifugada a 10.000 rpm por 10 min y el ácido t-cinámico, resultante de la bioconversión de fenilalanina, es aislado mediante extracción con solvente, empleando acetato de etilo en proporción 20 : 1. Finalmente el t-CA en la fase orgánica es medido espectrofotométricamente a 290 nm (DO290). La PAL producida por R. toruloides puede emplear alternativamente tirosina como substrato, produciendo ácido p-cumárico que absorbe a una longitud de onda muy cercana al ácido t-cinámico. Por ello fue requerida la validación de los resultados mediante HPLC. Resultados Las concentraciones de enzima y sustrato fueron optimizadas en relación a la actividad PAL, empleando diseños de superficie respuesta. A partir del análisis ANOVA, ambos parámetros resultaros estadísticamente significativos (