Efecto del medio de cultivo suplementado con diferentes concentraciones de zinc sobre la integridad del ADN y la apoptosis de células del cúmulus

ANCHORDOQUY JM; ANCHORDOQUY JP; PICCO SJ; SEOANE A; ROSA DE; MATTIOLI G; PERAL GARCÍA P; FURNUS C

Comarca Viedma-Patagones

Congreso; 33° Congreso Argentino de Producción Animal; 2010

Asociación Argentina de Producción Animal

EFECTO DEL MEDIO DE CULTIVO SUPLEMENTADO CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ZINC SOBRE LA INTEGRIDAD DEL ADN Y LA APOPTOSIS DE CÉLULAS DEL CÚMULUS. Anchordoquy J.M.12, Anchordoquy J.P.1, 2, Picco S.J.1, 2, Seoane A. 1, Rosa D.E.2, Mattioli G.2, Peral García P.1, Furnus C.1, 3. (1) Instituto de Genética Veterinaria (IGEVET), UNLP/CONICET, Calle 60 y 118 s/n (1900) La Plata; (2) Cátedra de Fisiología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP. (3) Cátedra de Citología, Histología y Embriología A, Facultad de Ciencias Médicas, UNLP. Effect of culture medium containing different zinc concentrations on DNA integrity and apoptosis rate of cumulus cells. El Zinc (Zn) cumple un rol esencial en el funcionamiento del ADN. Alteraciones en la maduración nuclear y citoplasmática de los ovocitos influyen directamente en la obtención de bajas tasas de gestación. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la tasa de apoptosis y el índice de daño en el ADN de células del cúmulus bovino, por la exposición a diferentes concentraciones de Zn durante la maduración in vitro de ovocitos (MIV). Los complejos ovocito-cúmulus (COCs) se obtuvieron de ovarios de vaquillonas de frigorífico. Los ovarios se colectaron en días diferentes, y en cada día se obtuvieron 200 COCs, usando 50 COCs por tratamiento. Los COCs se maduraron in vitro en medio TCM 199 con suero, FSH y LH, durante 24 hs a 39°C en atmósfera gaseada al 5% de CO2. Los COCs se cultivaron con distintas concentraciones de ZnSO4 agregadas al medio de MIV: Control (C)= medio de MIV sin agregado de Zn, Deficiencia (D= 0.7 μg/ml), Deficiencia marginal (DM= 1.1 μg/ml) y Adecuado (A= 1.5 μg/ml). El tratamiento A corresponde a concentraciones plasmáticas normales en bovinos. El análisis del daño del ADN se realizó mediante electroforesis en gel de células aisladas (Ensayo Cometa, versión alcalina). Las células de cada corrida electroforética fueron teñidas y analizadas con un sistema de captura y digitalización de imágenes acoplado a un software de análisis de imágenes microscópicas. El índice de daño es el resultado de la relación entre la cantidad de ADN migrado en el gel (ADN fragmentado, ?cola del cometa?) con la cantidad de ADN que no lo hizo (?cabeza del cometa?). La tasa de apoptosis fue evaluada utilizando la tinción de Anexina-V. El índice de daño en el ADN y la tasa de apoptosis fueron analizados utilizando el test de chi X² con corrección de Yates. Los resultados obtenidos muestran que los índices de células con daño en el ADN disminuyeron con la concentración de Zn (Tabla 1). TABLA 1 Efecto de diferentes concentraciones de Zn sobre la integridad del ADN de células del cúmulus evaluado por Ensayo Cometa.Tratamiento (Zn µg/mL)Número de Ovocitos Índice de Daño en el ADN C (0.3) a30067.5 ± 9.30 D (0.7) a30068.5 ± 13.3DM (1.1) b30033.8 ± 4.90 A (1.5) b30034.6 ± 7.90Los datos se expresan como la media ± ESM de 6 repeticiones. Los tratamientos con letras distintas son estadísticamente diferentes. Las diferencias fueron significativas entre C y los dos tratamientos de mayor concentración de Zn (DM y A): X2= 6.15 (P = 0.013) y X2= 7.79 (P < 0.01) respectivamente. No se encontraron diferencias entre C y D; ni entre DM y A.La tasa de apoptosis (células teñidas con anexina-V) fue mayor para el C que para el resto de los tratamientos con suplemento de Zn (Tabla 2).TABLA 2. Efecto de diferentes concentraciones de Zn sobre la tasa de apoptosis en células del cúmulus evaluado con Anexina V-FLUOS.Tratamiento (Zn µg/mL)Número de Ovocitos Índice de Daño en el ADN C (0.3) a3000.142 ± 0.07D (0.7) b3000.109 ± 0.032DM (1.1) b3000.102 ± 0.013A (1.5) c3000.057 ± 0.019Los datos se expresan como la media ± ESM de 6 repeticiones. Los tratamientos con letras distintas son estadísticamente diferentes. La tasa de apoptosis fue mayor para C que para el resto de los tratamientos [C vs D (P < 0.05); C vs DM y C vs A (P < 0.01) respectivamente], siendo el valor de A menor a D y a DM (P < 0.05).En conclusión, los presentes resultados indican que concentraciones de Zn similares a las concentraciones plasmáticas normales o disminuidas hasta un 70% de este nivel, protegen la integridad de las células del cúmulus durante la maduración in vitro.