Lipasa de Candida albicans modifica en forma diferencial la producción de oxido nítrico sobre macrófagos

PARAJE M.G; RENNA M.S; CORREA S.G; SOTOMAYOR C.E

Mar del Plata.

Congreso; Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas (SAIC - SAI - SAFE - SAN – SABiología – SABiofisica – SAF); 2004

En la interacción inicial entre el hongo, sus factores de virulencia y los tejidos del huésped, células de la inmunidad innata como los macrófagos están activamente involucradas. La capacidad de secretar lipasas (LIP)está descripta para algunas cepas de Cándida.albicans, sin embargo el significado biológico y el rol de estas enzimas en la patogenia y progresión de la infección aún no han sido establecidos. Se estudió la presencia de LIP en la cepa en estudio por screening en agar Saboreaud glucosado enriquecido con yema de huevo, observándose un halo de precipitación blanquecino alrededor de las colonias, por la acción de Lip. La cuantificación de la actividad enzimática fue realizada en agar Saboreaud enriquecido con aceite de oliva y Rodamina B, permitiendo la identificación de halos opacos con emisión de fluorescencia luego de la excitación con luz UV, proporcionales a la actividad Lip. Para la purificación de Lip, la cepa se cultivó en CN, durante 72 hs. El sobrenadante libre de células, se precipitó con NH4SO3 al 50% y dializó en PBS por 48 hs. La cepa de C.albicans fue productora de una lipasa extracelular, estimándose la actividad lipasa en 75 U y PM 70.79 kDa. Se evaluó el efecto de LIP sobre la vía metabólica dependiente de nitrógeno mediante la capacidad de inducir la producción de óxido nítrico (ON) vía óxido nítrico sintetasa (iNOS) frente a distintas condiciones: macrófagos purificados de ratas Wistar; obtenidos de un modelo de candidiasis (día 3 de la infección) y macrófagos tratados previamente con Cándida muerta por calor. Células bajo estas condiciones (1x106 cel/well) fueron cultivadas en presencia de dos concentraciones de LIP (25 U y 100 U) durante 24 y 48 hs, La generación de ON se evaluó en el sobrenadante del cultivo, mediante una técnica colorimétrica utilizando el método de Griess. La LIP fue capaz de gatillar la actividad de iNOS determinando una producción de significativa de ON sobre animales normales en forma dependiente de la concentración y tiempo de incubación. Mientrqas que células provenientes de animales infectados produjeron espontáneamente ON, a la menor dosis ensayada fue incapaz de modificar los nieveles de este metabolito, independientemente del tiempo de incubación, mientras que a la dosis mayor so observó una capaz de gatillar la actividad de iNOS determinando una producción de significativa de ON respecto a los niveles expresados “ex vivo”. Las células que previamente estuvieron en contacto con .......mostraron un marcada disminución de la producción de este metabolito frente a 100 de LIP. Para el estudio de la interacción de los macrófagos con la lipasa se observó injuria de la célula inmune liberación de la enzima lactato dehidrogenasa (LDH). La liberación de LDH al medio extracelular se determinó por colorimetría y los resultados se expresaron como índice de actividad LDH respecto al basal.