Micosíntesis de Nanopartículas de Plata, su Caracterización y su Actividad Antifúngica frente al Fitopatógeno Botrytis cinerea

MARTIN FERNANDEZ BALDO; JORGE G. FERNANDEZ; MATIAS REGIART; PEREIRA SIRLEY V.; SANZ M.I.; JULIO RABA

Congreso; XXIX Congreso Argentino de Química “CENTENARIO DE LA ASOCIACIÓN QUÍMICA ARGENTINA; 2012

Introducción Botrytis cinerea es un hongo fitopatógeno que causa la podredumbre gris, una enfermedad de postcosecha que afecta una amplia variedad de frutas [1]. Además, el crecimiento de este hongo es difícil controlar, debido a que ha desarrollado resistencia a muchos fungicidas efectivos utilizados para su control [2]. Para vencer esta resistencia, es importante investigar nuevos agentes antifúngicos, que puedan sustituir a las estrategias actuales de control. Recientes trabajos indican que la síntesis biológica, en particular micosíntesis de nanopartículas de plata (Ag NPs), es confiable, respetuosa del medio ambiente y han recibido una atención especial debido a sus propiedades antimicrobianas [3,4]. El objetivo del presente trabajo fue sintetizar extracelularmente Ag NPs a partir deAspergillus niger, caracterizar las mismas y evaluar su actividad antifúngica contra el fitopatógeno Botrytis cinerea. Metodología Se inoculó 100 mL de A. niger NRRL 1419 (2 x 106 esporas mL-1) en un medio líquido que contenía 2,0 NaNO3; 0,1 KH2PO4; 0,5 MgSO4 7H2O; 0,5 KCl; 3,0 sacarosa; 0,03 estreptomicina (g L-1) y se lo incubó a 28±1 °C con agitación orbital a 100 rpm. Luego de 72 h de incubación, la biomasa fúngica se filtró a través de un papel de filtro Whatmann Nº1 y se lavó con agua destilada. A continuación, 20 g de biomasa fúngica se transfirió a un Erlenmeyer que contenía 150 mL de agua destilada y se incubó durante 72 h (28±1 °C, 100 rpm). Posteriormente, la biomasa se filtró nuevamente, al filtrado se le adicionó 100 mL de AgNO3 (1mM) y se lo incubó por 72 h (28±1 °C, 100rpm) en oscuridad. El filtrado de la biomasa (sin el agregado de AgNO3) y el AgNO3 en solución se utilizaron como controles negativos y positivos respectivamente. Posteriormente, las Ag NPs sintetizadas fueron caracterizadas por espectrofotometría UV-visible y por microscopía electrónica de transmisión (MET). Además, se determinó la presencia de la enzima nitrato reductasa obtenida a partir del filtrado de la biomasa de A. niger siguiendo el procedimiento propuesto por Harley [5] y Saifuddin [6]. Para esto, 5 mL de alícuotas del filtrado se mezclaron con 5 mL de medio de ensayo (30 mM KNO3 y 5% propanol en tampón fosfato,0,1 M, pH 7,5) y se lo incubó en oscuridad durante 1 h. Luego de la incubación, los nitritos formados se estimaron mediante la adición de 2,5 mL de sulfanilamida y N-etileno (1-naftil)-diamina dihidrocloruro. El color desarrollado se midió en un espectrofotómetro UVvis. La actividad de la enzima se expresó finalmente en nmoles de nitrito h-1 mL-1.Finalmente, la actividad antifúngica de las Ag NPs fue evaluada por inhibición del crecimiento de B. cinerea BNM 0527 en placas de cultivo Agar-Papa-Dextrosa. Para esto, se sembraron 200 μL del fitopatógeno a una concentración de 106 esporas mL-1,posteriormente se practicaron orificios de 3x3 mm de diámetro y se adicionaron a los mismos 60 μL de Ag NPs, el control negativo y el positivo, respectivamente. Luego, las placas se incubaron a 28±1 °C durante 7 días y fina lmente, se midieron los halos de inhibición expresando los resultados en mm. Resultados El objetivo principal del presente trabajo fue la producción, caracterización y aplicación de una nueva estrategia para obtener Ag NPs por síntesis biológica. Estas Ag NPs fueron aplicadas al control de B. cinerea. La biosíntesis de Ag NPs se realizó a partir de una cepa pura de A. niger (NRRL 1419). Esta cepa de A. niger se cultivó y se obtuvo el filtrado del hongo, el cual se lo incubó a continuación con AgNO3 apareciendo un color marrón oscuro, mientras que los frascos que contenían los controles permanecieron sin cambios durante el período de incubación de 72 h. El color marrón oscuro, luego de la síntesis, indica la presencia de Ag NPs, las cuales fueron confirmadas por espectrofotometría mostrando una banda de absorción alrededor de los 440 nm para la cepa de A. niger estudiada (Figura 1). Además, las Ag NPs fueron caracterizadas por MET, mostrando una distribución de tamaños de 40±20 nm (Figura 2).