INMUNOSENSOR MICROFLUIDO APLICADO A LA DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A EN MUESTRAS DE MANZANA

MARTIN FERNANDEZ BALDO; FRANCO A. BERTOLINO; SIRLEY V. PEREIRA; LEONARDO MARIÑO REPIZO; MARIA I. SANZ; JULIO RABA

Lanús Bs. As. Argentina

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Química y 4to. Workshop de Química Medicinal; 2010

Asociación Química Argentina

INMUNOSENSOR MICROFLUIDO APLICADO A LA DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A EN MUESTRAS DE MANZANA Martín A. Fernández-Baldo, Franco A. Bertolino, Sirley V. Pereira, Leonardo Mariño Repizo, Germán A. Messina, Maria I. Sanz, Julio Raba INQUISAL, Departamento de Química. Universidad Nacional de San Luis, CONICET. Chacabuco 917. D5700BWS. San Luis, Argentina. E-mail: jraba@unsl.edu.ar Introducción La ocratoxina A (OTA) es un metabolito producido por muchas especies de hongos que contaminan los alimentos, como Penicillium verrucosum, Aspergillus ochraceus y Aspergillus níger [1]. En humanos, se la ha relacionado con la etiología de la nefropatía endémica balcánica y con el estallido de tumores del tracto urinario. IARC (Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer) la ha clasificado como ''posible carcinógeno humano (grupo 2B)" [2]. También efectos teratogénicos y carcinógenos han sido descriptos en algunas especies animales [3]. OTA se puede encontrar en un gran número de alimentos. El Comité Científico para la Alimentación considera que sería prudente reducir la exposición a la OTA en lo posible, estableciendo una ingesta diaria tolerable de 0.005 ppb de peso corporal / día [4]. En frutas y hortalizas, los límites permitidos varían de 10 a 50 ppb con 10 ppb como el pico dominante [5]. Por otra parte, los límites permitidos de OTA específicamente en manzanas no han sido aún establecidos. Muchas técnicas de detección han sido utilizadas para la determinación de OTA en diferentes tipos de muestras como: cromatografía en capa fina, HPLC, cromatografía de gases, fluorescencia, espectrometría de masas, columnas de inmunoafinidad o ELISA. Estos métodos utilizan equipamiento costoso, largos periodos de tiempo de análisis, los protocolos de extracción son laboriosos y requieren de personal capacitado [6,7]. Por lo tanto el desarrollo de metodologías simples, con elevada sensibilidad y especificidad sería sumamente útil.El objetivo de este trabajo fue desarrollar un inmunosensor microfluidico con detección electroquímica en un formato de biochip para cuantificar OTA en muestras de manzanas infectadas con Aspergillus ochraceus. Metodología El cuerpo del sensor fue construido de Plexiglas (Figura 1). La detección de OTA se llevó a cabo utilizando un inmunoensayo competitivo indirecto, basado en el uso de anticuerpos monoclonales anti-OTA inmovilizados sobre nanopartículas magnéticasmodificadas con grupos 3-aminopropil. Las nanopartículas magnéticas fueron inyectadas dentro de los microcanales del dispositivo y manipuladas por imanes externos removibles. OTA presente en la muestra de manzana compite inmunológicamente con OTA marcada con la enzima Peroxidasa (HPR) por los sitios de reconocimiento del anticuerpo anti-OTA específico inmovilizado. Luego del lavado, la enzima HPR, en presencia de peróxido de hidrogeno (H2O2) cataliza la oxidación de 4-ter-butilcatecol (4-TBC), cuya reducción electroquímica fue detectada sobre la superficie del electrodo de oro a -0.15 V. La respuesta de corriente obtenida de la reducción del producto de reacción enzimática es proporcional a la actividad de la enzima y por lo tanto, inversamente proporcional a la cantidad de OTA unida a la superficie del inmunosensor de interés.Figura 1. Representación esquemática del inmunosensor. WE: electrodo de trabajo de oro; PMB: nanopartículas magnéticas; CC: canal central. Todas las medidas fueron realizadas en milímetros. Resultados El sistema fue optimizado a una velocidad de flujo de 5 µL min -1. La máxima sensibilidad se logró en un rango entre 5 y 20.0 µL de volumen de nanopartículas inyectadas. La máxima respuesta enzimática fue a pH 5 en buffer fosfato-citrato 0.1M. Para el método propuesto se obtuvo una curva de calibrado para la detección de OTA, en un rango de 0-40 ppb. La ecuación de regresión lineal fue i=199.29 - 4.55 COTA, con un coeficiente de regresión lineal r=0.998. El coeficiente de variación (CV) para la determinación de 20 ppb de OTA fue menor que 4.1% (n=6). El sistema electroquímico fue comparado con un sistema espectrofotométrico comercial [8] para la cuantificación de OTA en 28 muestras. Las pendientes obtenidas fueron cercanas a 1, indicando una buena correspondencia entre los dos métodos. El límite de detección para la determinación electroquímica y espectrofotométrica (ELISA) fue de 0.05 y 1.90 ppb, respectivamente, por lo tanto el método propuesto es significativamente más sensible. Conclusiones En este estudio se desarrolló un inmunosensor microfluido acoplado a un sistema deinyección en flujo y detección electroquímica capaz de cuantificar OTA en forma rápida, sensible y selectiva. El tiempo total de análisis fue de 27 min. La utilización de nanopartículas magnéticas modificadas con anticuerpos anti-OTA específicos, como procedimiento de pre-tratamiento para purificar y enriquecer la muestra, permitió un importante incremento de la sensibilidad sin reducir la selectividad, siendo esta una primordial ventaja. Además este sistema disminuyó el gasto de costosos reactivos, demostró estabilidad física y química, baja corriente de fondo, amplio rango de potencial de trabajo, precisión y exactitud. El inmunosensor desarrollado permitió la determinación in-situ de OTA, sin necesidad de equipamiento costoso ni personal altamente capacitado, demostrando su aplicabilidad como técnica de rutina en la determinación de micotoxinas en muestras alimentarias. Referencias [1] A. Aresta, R. Vatinno, F. Palmisano, C. Zambonin. Journal of Chromatography A. 1115 (2006) 196–201. [2] IARC. Ochratoxin A. IARC Monograph on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. Lyon. 56 (1993) 489–521. [3] D. Vesela, D. Vesely, R. Jelınek. Appl. Environ. Microbiol. 45 (1983) 91–93. [4] SCF (Scientific Committee on Food), 1998. Opinion of the Scientific Committee on food on ochratoxin A (expressed on 17 September 1998). Directorate— Scientific Opinions. European Commission, Brussels, Belgium. [5] Mycotoxins in Fruits and Vegetables Edited by Rivka Barkai-Golan and Nachman Paster, 2008, Elsevier. [6] A. Pittet, A. Mitt. Lebensm. Hyg. 96 (2005) 424–444. [7] B. Zimmerli, R. Dick. Food Addit. Contam. 6 (1996) 655–668 [8] AgraQuant® for Ochratoxin A Test ELISA Kit, 2009. AgraQuant® Misiones/Argentina (Instruction Manual).