Las HMGBs de tripanosomas presentan un dominio adicional de interaccion con el ADN

SOFIA NARANJO; VICTORIA LUCIA ALONSO; CARLA RITAGLIATI; PAMELA CRIBB; ESTEBAN SERRA

Rosario

Simposio; XXV Reunion Anual de la Sociedad Argentina de Protozoologia y Enfermedades ParasitariasI; 2013

Sociedad Argentina de Protozoologia y Enfermedades ParasitariasI

Las proteínas HMG (High Mobility Group) constituyen una superfamilia de proteínas que llevan a cabo diversas funciones nucleares a través de la remodelación de la estructura de la cromatina. Además de estar presente en el núcleo, la proteína HMGB1 de mamíferos puede sufrir modificaciones post-traduccionales (como la acetilación), señal que indicaría la secreción al medio extracelular donde es capaz de actuar como mediador de la respuesta inmune. Por búsquedas bioinformáticas, se identificó en nuestro laboratorio una proteína homóloga a HMGB en Trypanosoma cruzi denominada TcHMGB. Esta proteína cuenta con dos dominios de unión al ADN ?HMG box? al igual que la proteína HMGB1 de animales, pero en lugar de la región acídica carboxilo terminal presente en la mayoría de las HMGBs, TcHMGB posee una región amino terminal exclusiva de las HMGBs de tripanosomátidos. Realizando estudios in silico, encontramos que dicha secuencia amino terminal contendría una señal de localización nuclear putativa (NLS) y un dominio ?DEK-C? de unión al ADN. Por ensayos de retardo en gel y de circularización por T4 ligasa, hemos probado que la proteína tiene la capacidad de unir ADN cruciforme, así como también doblar ADN lineal. Esta interacción dependería de la estructura y no de la secuencia del ADN. Dado que Trypanosoma cruzi no presenta promotores canónicos ni factores generales de la transcripción del tipo clásicos, consideramos que la regulación epigenética sería clave para regular el inicio de la transcripción. Para realizar un estudio más exhaustivo de la proteína TcHMGB, con especial atención en la región amino terminal , se clonaron los fragmentos NLS, DEK y la región amino terminal completa en el vector de entrada pENTR-3C para luego ser transferidos (por una reacción de recombinación LR clonasa de Invitrogen) al vector de destino pDEST17 que permite obtener los distintos fragmentos fusionados a una cola de Histidinas. Posteriormente efectuamos la expresión y purificación de la construcción N-terminal fusionada a His, la cual se expresó mayoritariamente de forma insoluble. De esta manera, proseguimos a clonar las distintas versiones de la proteína trunca (N-terminal y ΔN) como fusiones a la proteína Glutatión S Transferasa (GST) utilizando el vector pGEX-3X-GW. Con esta nueva estrategia se intenta obtener las proteínas recombinantes en condiciones solubles, para luego efectuar los ensayos de unión al ADN in vitro similares a los realizados con la proteína entera y así determinar.