OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA RECEPTOR DE PROGESTERONA HUMANO PARA SER APLICADO EN EL DIAGNÓSTICO INMUNOHISTOQUÍMICO DE BIOPSIAS ONCOLÓGICAS

MORENO PIOVANO GS; RAMOS JG; RODRÍGUEZ HA; VARAYOUD JG; MUÑOZ DE TORO MM; LUQUE EH

Escuela de Medicina, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Santa Fe, Argentina

Congreso; Décimo Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad Nacional del Litoral y Primer Encuentro de Jóvenes Investigadores de Universidades de Santa Fe; 2006

Universidad Nacional del Litoral

Introducción El desarrollo de insumos para diagnóstico médico, que por su calidad y costo sean aptos para sustituir importaciones de alto valor agregado, es una prioridad en las políticas científicas-tecnológicas de nuestro país. Debido a la actual crisis económico-social, la mayoría de los habitantes de bajos y medios recursos de nuestra región accede a la atención médica general y a los servicios de diagnóstico en Hospitales Públicos. Dentro de estas prestaciones, el diagnóstico inmunohistoquímico de receptores hormonales en tumores de mama y endometrio, tales como los receptores de estrógenos (ER) y progesterona (PR), son usados en la clínica médica para definir la terapéutica correcta y para predecir el curso de la enfermedad tumoral .Todos los sistemas de diagnóstico basados en técnicas inmunohistoquímicas que se utilizan en los laboratorios de anatomía patológica (públicos o privados) de nuestro país, son completamente desarrollados en el extranjero. Estos sistemas han incrementado notablemente su costo a partir del cambio del valor relativo del dólar norteamericano, impidiendo que numerosas instituciones de salud pública brinden el servicio. El desarrollo actual de las técnicas de ADN recombinante y la aplicación de programas de bioinformática al diseño de péptidos, permiten generar antígenos proteicos cuyas secuencias no sean compartidas por otras proteínas, obteniéndose de este modo anticuerpos policlonales con bajos niveles de reactividad cruzada. Los antígenos proteicos seleccionados pueden ser expresados como proteínas de fusión en células procariotas, incrementando de este modo la respuesta inmune del huésped, ya que la proteína de fusión actúa como un potente inmunógeno. De este modo se obtiene un suero altamente reactivo y de alta especificidad (lo que disminuye la posibilidad de reacciones cruzadas). Objetivos 1) obtener antígenos recombinantes correspondientes a porciones antigénicas del PR humano mediante expresión heteróloga en células procariotas, para la producción y purificación de anticuerpos policlonales. 2) obtener, caracterizar y purificar anticuerpos policlonales monoespecíficos de conejo contra el PR humano. 3) validar los anticuerpos obtenidos comparando su reactividad y especificidad en ensayos de inmunohistoquímica con sistemas comerciales del mercado internacional. Materiales y Métodos 1) Obtención del antígeno recombinante. Para la determinación de las homologías entre las diferentes secuencias génicas se utilizó la herramienta bioinformática de dominio público BLAST 2.2.1.3. Para el cálculo de la antigenicidad teórica de secuencias polipeptídicas se utilizó el programa VECTOR NTI 6.0. Se purificó ARN total proveniente de placenta humana por el método del cloroformo-fenol-alcohol isoamílico. Se amplificó por RT-PCR la fracción del gen PR elegida y se diseñó una estrategia de clonado direccional usando el vector plasmídico pGEX 4T-3 (Amersham). Se insertó el fragmento amplificado en los sitios XhoI y EcoRI de tal manera de mantener el marco abierto de lectura con el gen de la enzima glutatión-S-transferasa (GST) obteniéndose el constructo pGEXGST-PR. Con este constructo se transformaron bacterias E. coli DH5alfa (Invitrogen) por el método del Cl2Ca (Sigma). Las colonias transformantes fueron seleccionadas usando el antibiótico ampicilina y los clones recombinantes fueron identificados por PCR usando oligonucleótidos específicos para el fragmento PR. Con los clones seleccionados se transformaron bacterias E. coli JM109 (Stratagene), escalando el cultivo a 200 ml. Se indujo la expresión de la proteína recombinante GST-PR con el agregado de IPTG (Promega) en una concentración final de 250 nM. La expresión de la proteína se evaluó cuantitativamente por espectroscopia UV y ensayos de ELISA indirecto. 2) Obtención y purificación de anticuerpos anti-RP humano.2) Obtención y purificación de anticuerpos anti-RP humano. Para la generación de los anticuerpos se procedió a la inoculación de dos conejos (A y B), con el antígeno GST-PR. Se tomó una muestra de sangre de la cual se obtuvo el título del suero basal y luego se inyectó en forma subcutánea 100 ul por sitio (3 sitios) de la preparación constituida por 300 ul del antígeno diluido en PBS (1 ug/ul) y 300 ul de adyuvante completo de Freund (Sigma). Se realizaron 3 booster con adyuvante incompleto (Sigma) en los días 15, 45 y 60 posteriores a la primera inoculación. Para seguir la evolución del título de los anticuerpos se utilizaron ensayos de ELISA indirectos sensibilizando placas de poliestireno de 96 pozos con 200 ng/pozo de GST-PR. Para purificar los anticuerpos específicos se realizó una cromatografía de afinidad para IgG específicas de 8 ml del antisuero mediante el uso de una columna HiTrap NHS-Sefarosa activada (Amersham) a la cual se le acopló 10 mg del antígeno GST-PR. A las fracciones de elución se las concentró utilizando tubos de filtración forzada (Centricon, límite de paso 30 KDa, Millipore). La elución de los anticuerpos se evaluó cuantitativamente por espectroscopia UV. 3) Validación de los anticuerpos por inmunohistoquímica Para la evaluación de la reactividad del anticuerpo en IHQ, se realizaron ensayos indirectos utilizando muestras de tejido correspondientes a biopsias de cérvix uterino y tumores mamarios humanos. Se ensayaron diluciones sucesivas desde 1/10 hasta 1/400 del anticuerpo primario anti-GST-PR (PR-131), y como anticuerpo secundario se utilizaron anti-inmunoglobulinas de conejo (Zymed) diluídos 1/200 en PBS-Leche 1%. Como anticuerpos de referencia se utilizaron el anti-PR de DAKO A0098 (USA) y el anticuerpo monoclonal NCL-PGR.312 de Novocastra Laboratories (UK). El revelado se efectuó con diaminobencidina en Tris-HCl-H2O2. Se determinó el porcentaje de células positivas para el PR nuclear presentes en las biopsias y se evaluó estadísticamente la existencia de diferencias significativas entre los anticuerpos comerciales y el obtenido en el presente trabajo. Las comparaciones se efectuaron mediante el análisis de la varianza (One way ANOVA), entre el promedio de los porcentajes de células positivas marcadas con los tres anticuerpos en estudio, y con el test estadístico t, aplicado al promedio de los porcentajes de células tumorales marcadas con los anticuerpos PR-131 y NCL-PGR.312. Resultados Los resultados de los estudios bioinformáticos revelaron que el dominio de transactivación A/B es la región del PR que menos homología posee con el resto de los genes de la familia de los receptores nucleares. Se utilizó un fragmento de este dominio que va desde el nucleótido 1588 al 1701 del ARNm humano (NM_000926) codificando un polipéptido que incluye los aa 530 a 567 de la secuencia proteica. En este polipéptido se encontraron 2 regiones altamente antigénicas con la secuencia PYLNYLRPDS y SLPQK respectivamente. La inducción de la proteína recombinante usando caldo de cultivo TB resultó en una mayor densidad celular que la obtenida usando el medio LB. Se obtuvieron masas de proteína recombinante de 4 mg ± 0,4 cada 200 ml de cultivo en forma completamente soluble. La proteína recombinante fue purificada por cromatografía de afinidad usando columnas de glutatión sefarosa, obteniéndose grados de pureza superiores al 90%. El plegamiento correcto de la proteína fue evidenciado utilizando una metodología de ELISA indirecto, en el cual se usó un anticuerpo primario comercial que reconoce la presencia del epitope PYLNYLRP. El título alcanzado con el protocolo de inmunización fue de 1/256.000 en el conejo A y 1/128.000 en el conejo B. Para comprobar la especificidad de los anticuerpos obtenidos se realizaron ensayos de western blot a partir de homogenatos de proteínas nucleares provenientes de placenta humana. Se observó el desarrollo de 2 bandas de 82 y 116 KDa correspondientes a las isoformas A y B del PR. Los ensayos de inmunohistoquímica realizados en biopsias incluídas en parafina de cérvix uterino mostraron una tinción claramente nuclear en las células del epitelio glandular y del estroma subepitelial. En la evaluación cuantitativa realizada en biopsias de cérvix uterino, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el número de células positivas para PR entre nuestro anticuerpo y los anticuerpos comerciales DAKO A0098 y NCL.PGR.312. Las evaluaciones realizadas en biopsias incluídas en parafina de tumores mamarios revelaron que utilizando el anticuerpo PR131 el número de células positivas encontradas fue mayor que el obtenido con el anticuerpo comercial NCL.PGR.312 (P<0.05), Tabla 1). Esto demuestra que el anticuerpo PR-131 comparte e incluso supera la capacidad reactiva y la especificidad de los anticuerpos comerciales en ensayos realizados sobre biopsias quirúrgicas humanas. Células glandulares de cérvix humano positivas (%) Células estromales de cérvix humano positivas (%) Células epiteliales de tumor de mama positivas (%) PR-131 92 ± 0,05 85 ± 0,09 95 ± 0,02 (*) NCL.PGR.312 88 ± 0,05 90 ± 0,02 89 ± 0,01 DAKO A0098 88 ± 0,08 75  ± 0,10 - TABLA1: Análisis cuantitativo de la inmumarcación de PR obtenida con los anticuerpos evaluados. En biopsias incluídas en parafina de tumores mamarios se observó una mayor proporción de células positivas con el anticuerpo PR-131 (*: P<0.05). Conclusiones Los resultados demuestran que el anticuerpo PR-131 presenta características inmunológicas y bioquímicas aptas para ser utilizado como anticuerpo primario en ensayos de IHQ en biopsias humanas. Su alta especificidad y reactividad permitirían aplicarlo en la exploración de patologías oncológicas y/o reproductivas.