La regulación estrogénica de la expresión del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en el hipocampo y la corteza del ratón involucra diferentes promotores

DUDIUK CB; FALCO G; MORENO PIOVANO GS

Escuela de Medicina, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Santa Fe, Argentina

Congreso; Décimo Tercer Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad Nacional del Litoral y Cuarto Encuentro de Jóvenes Investigadores de Universidades de Santa Fe; 2009

Universidad Nacional del Litoral

El  incremento  significativo  de  la  expectativa  de  vida  es  el  resultado  de  numerosos avances   biomédicos  tales   como,   el  desarrollo   de   vacunas   y   antibióticos   contra enfermedades infecciosas y la mejoría de la atención médica en general. Sin embargo los esfuerzos para aumentar la longevidad de la población no han evitado el aumento de la incidencia de patologías neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA) y el deterioro cognitivo asociado a la edad. Numerosos  estudios  realizados  en  animales  de  laboratorio  han  acumulado  evidencia acerca del papel crucial que poseen los estrógenos en el desarrollo del sistema nervioso. Estas    hormonas     demostraron    ejercer     importantes     efectos    neurotróficos     y neuroprotectores, entre los cuales se destaca su capacidad de modular la expresión de factores de crecimiento neurotróficos en diversas estructuras cerebrales, especialmente en  aquellas  relacionadas  con  la  memoria  (hipocampo  y  sus  relaciones  corticales  y septales). Uno de los miembros mas importantes de la familia de las neurotrofinas es el BDNF  (brain  derived  neurotrophic  factor),  el  cual  juega  un  rol  importante  en  la proliferación,  diferenciación  y  supervivencia  de  las  neuronas,  por  lo  que  ha  sido implicado en mecanismos de aprendizaje y memoria. La expresión del gen BDNF puede ser  modulada  por  los  estrógenos,  sin  embargo,  los  mecanismos  por  los  cuales  estas hormonas afectan dicho proceso aún no están bien elucidados (Solum y Handa, 2002). La  declinación  de  los  niveles  de  estrógenos,  durante  la  menopausia  compromete seriamente el desarrollo normal de las células nerviosas, aumentando de esta manera el riesgo de padecer enfermedades neurodegenerativas. Resultados favorables obtenidos con animales ovariectomizados, tratados con estradiol, permitieron  reforzar  la  evidencia  de  que  las  terapias  hormonales  de  reemplazo  (THR) podrían  contrarrestar  estos  efectos.  Sin  embargo  los  estudios  en  humanos  trajeron aparejadas ciertas controversias, debido a que se observó en ciertos pacientes la falta de respuestas  o una respuesta desfavorable a estas terapias. Se postula que existirían variables  inherentes  a  las  pacientes,  tales  como  el  tiempo  transcurrido  desde  el comienzo de la menopausia hasta el inicio de la THR, la edad en la que inicia la THR, etc., que podrían condicionar la acción neuroprotectora de las THR.  Por lo anteriormente expuesto, se hace notoria la necesidad de conocer los mecanismos celulares y moleculares de la acción de las hormonas sobre diversas áreas del cerebro con  el  fin  de  posibilitar  el  diseño  de  terapias  adecuadas  para  los  pacientes  con enfermedades neurodegenerativas, incluyendo a aquellos que no responden o lo hacen desfavorablemente a las distintas THRs tradicionales. Objetivos Evaluar  la  influencia  de  un  tratamiento  agudo  con  17beta-estradiol  (E2)  sobre  la expresión  de  BDNF  y  sus  variantes  transcripcionales  en  el  hipocampo  y  corteza  de ratones hembra ovariectomizadas (OVX). Metodología (materiales y métodos, si corresponde)  1-  MODELO ANIMAL 1.1)     Animales Se utilizaron ratones (Mus Musculus) albinos de la cepa CF-1, de aproximadamente 3 meses de edad. Todos los animales del experimento se sometieron a OVX bilateral con el fin de quitar la principal fuente natural de estrógenos y progesterona.  1.2)     OVX Bilateral Para realizar la OVX se procedió de acuerdo a la técnica quirúrgica de acceso dorsal. Luego de la cirugía se realizaron extendidos vaginales para controlar los efectos de la ausencia de esteroides ováricos.    1.3)     Grupos Experimentales Los ratones OVX fueron asignados al azar a cada uno de los grupos experimentales diseñados utilizando un mínimo de 12 animales en cada grupo: -Grupo-E (grupo tratado): animales OVX a los 3 meses de edad y tratados a los 10 días post OVX con una única dosis de 2 mcg de E2. -Grupo-C  (grupo  control):  animales  controles  del  grupo  E.  Estos  animales fueron OVX a los 3 meses de edad y tratados a los 10 días post OVX con una única dosis de 100 mcl de aceite de sésamo (vehiculo de E2). Los animales de los grupos experimentales se sacrificaron a las 2 hs. de realizado el tratamiento con E2.  2-  OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS 2.1) Para estudios por microscopía óptica Todos  los  animales  experimentales  fueron  sacrificados  mediante  decapitación  con guillotina.  Se  colocó  la  cabeza del animal  en una  tabla  de disección,  y  sujetándolo con las manos, se procedió a retirar la piel y la musculatura cefálica mediante el uso de una tijera quirúrgica. Seguidamente se separaron los huesos craneales mediante un  corte  sagital-medial  del  cráneo  a  través  de  la  sutura  sagital.  Rápidamente  se procedió a la extracción del cerebro separándolo del cráneo por corte de los nervios ópticos con la ayuda de una pinza. Los cerebros completos se fijaron por inmersión en una solución de paraformaldehído al 4%. El procedimiento hasta su inclusión en tacos de parafina que se aplicó fue  el descripto por Junqueira y Junqueira (1983).  2.2) Para estudios por RT-PCR en tiempo real Una vez extraído el cerebro se colocó sobre una tabla de microdisección en posición ventral  hacia  arriba.  A  continuación  se  realizaron  cortes  para  lograr  extraer  el hipocampo   y   corteza   adyacentes.   Luego   de   la   extracción   las   muestras   se conservaron  a  -80ºC  hasta  su  procesado.  Las  muestras  de  hipocampo  y  corteza obtenidas  fueron  utilizadas  para  la  extracción  de  ARN  total  mediante  el  uso  del reactivo  comercial  ?TRIZOL  Reagent?  (Invitrogen,  Buenos  Aires,  Argentina),  para luego obtener ADN copia (ADNc) por retrotranscripción (RT). 3-  EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL BDNF La  expresión  del  BDNF  en  hipocampo  y  corteza  fue  evaluada  mediante  dos metodologías: inmunohistoquímica (IHQ) y RT-PCR en tiempo real. 3.1) IHQ Cuantitativa Para  realizar  los  ensayos  de  IHQ  se  siguió  la  metodología  de  rutina  en  nuestro Laboratorio  (Muñoz-de-Toro  et  al,  1998),  utilizando  un  anticuerpo  comercial  para BDNF (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA, USA). 3.2) RT-PCR en tiempo real Usando   el   ADNc   generado   en   la   reacción   de   RT   se   procedió   a   evaluar cuantitativamente   la   expresión   del   ARNm   total   del   BDNF   y   sus   variantes transcripcionales mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.  El  cálculo  de  los  niveles  de  expresión  relativa  de  cada  muestra,  se  realizó utilizando el método de Pfaffl (Pfaffl, 2001). Como control interno para las diferentes comparaciones se utilizó la determinación de ARN 18s. Resultados alcanzados 1)  IHQ para BDNF Se  observó  inmunomarcación  en  el  soma  y  las  prolongaciones  axónicas  de  las neuronas ubicadas en las regiones CA1, CA3, zona polimórfica (ZP) y giro dentado (GD)  del  hipocampo.  Al  realizar  el  análisis  de  los  ensayos  encontramos  que  los animales que recibieron un tratamiento agudo con E2 presentaron marcación similar en  hipocampo  y  corteza  respecto  a  sus  controles,  no  presentando  diferencias significativas.   2)  Cuantificación del ARNm  del BDNF La  cuantificación  del  ARNm  total  del  BDNF  se  realizó  por  medio  de  RT-PCR  en tiempo real mediante el uso de oligonucleótidos que hibridan en la región codificante del exón VI (común a todas las variantes de corte alternativo). A diferencia de lo observado por IHQ se encontró una mayor expresión  del ARNm de  BDNF  en  el  hipocampo  y  corteza  de  los  animales  E  (p