Evaluación de la utilidad de sparfloxacina como tratamiento contra Mycoplasma spp. en la línea celular de granulosas bovinas (BGC-1).

ETCHEVERS L; STASSI AF; CATTANEO MOREYRA L; RODRÍGUEZ FM; CHIARAVIGLIO JA; OLMOS NICOTRA MF; DIAZ PU; ORTEGA HH; REY F; SALVETTI NR; AMWEG AN

Esperanza

Jornada; IX Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión; 2021

Facultad de Ciencias Veterinaria - Universidad Nacional del Litoral

El uso de líneas celulares como herramienta para el estudio funcional de genes y proteínas como así también para la producción de sustancias bioactivas requiere un control de calidad riguroso para excluir la contaminación con microrganismos1. En este sentido, la contaminación con micoplasmas resulta importante debido a su alta incidencia.Los micoplasmas son un grupo de microorganismos que pertenecen a la clase Mollicutes y se caracterizan por su pequeño tamaño y la ausencia de pared celular. La contaminación con micoplasmas genera múltiples efectos sobre las células eucariotas en cultivo ya que son capaces de alterar casi todos los parámetros celulares: proliferación, vías de señalización, vías enzimáticas, antígenos de la membrana plasmática e, inclusive, propiedades del genoma, transcriptoma y proteoma de las células huésped1,2. Además, debido a la competencia y agotamiento de nutrientes esenciales presentes en el medio de cultivo, se altera la capacidad de síntesis de proteínas, ADN y ARN. Dichas alteraciones influyen considerablemente en los resultados obtenidos, resultando además en pérdidas económicas. En conclusión, para el desarrollo y uso de sistemas de cultivos de líneas celulares resulta primordial contar con líneas libres de la contaminación con Mycoplasma spp.Dentro de los métodos utilizados para eliminar Mycoplasmas spp. de los cultivos celulares se incluyen métodos físicos, químicos, inmunológicos y basados en antibióticos. Sin embargo, los métodos de eliminación de estas bacterias idealmente deberían ser simples, rápidos, eficientes, confiables y económicos. También, deberían tener efectos mínimos sobre las células eucariotas cultivadas2. En ese sentido, se ha demostrado que cuatro clases de antibióticos son muy eficaces en el tratamiento de micoplasmas: tetraciclinas, pleuromutilinas, macrólidos y fluoroquinolonas. Estos antibióticos pueden usarse en concentraciones relativamente bajas, con baja probabilidad de desarrollo de resistencia y con efectos bajos o nulos sobre las células eucariotas.El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar la efectividad de dos tratamientos antibióticos contra Mycoplasma spp. y su posible efecto sobre las características fenotípicas de la línea celular BGC-1 (Bovine Granulosa Cell 13). Para ello, las células contaminadas con Mycoplasma spp fueron mantenidas en frascos T25 al 80% de confluencia en medio Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 (DMEM-F-12, Gibco) suplementado con suero fetal bovino 20%. En caso de ser necesario, las células fueron subcultivadas para asegurar la confluencia del 80%. El tratamiento 1 consistió en aplicar sparfloxacina (Sigma-Aldrich) 10 µg/ml cada 24 h durante 7 días consecutivos. Por el otro lado, el tratamiento 2 consistió en adicionar a las células sparfloxacina 10 µg/ml cada 48 h durante 14 días consecutivos. La eficacia del tratamiento se evaluó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de punto final una vez finalizado el tratamiento (día 0 postratamiento) y 7, 14, 21 y 28 días postratamiento (pt). Para ello, alrededor de 2x105 células fueron recogidas en PBS y luego sembradas en la PCR utilizando un set de cebadores específicos4. Además, 5x105 células fueron fijadas en un portaobjeto utilizando una citocentrífuga y, posteriormente, sometidas a inmunocitoquímica (ICQ) para la evaluación de la expresión de la enzima aromatasa (CYP19A1). Brevemente, las células se fijaron en metanol frío y, luego, se permeabilizaron con tritón X-100 0,2% durante 10 min. A continuación, se incubaron con el anticuerpo primario (CYP19 clon H-300, sc-30086, Santa Cruz Biotechnology) durante toda la noche a 4 °C. La detección se realizó utilizando el kit CytoScan HRP Detection System (Cell Marque) y 3,3-diaminobencidina (DAB, Thermo Fisher Scientific) como cromógeno. Finalmente, los portaobjetos se lavaron con agua destilada, se contracolorearon con hematoxilina y se realizó el montaje.El tratamiento 1 resultó efectivo el día 0 pt. Sin embargo, 7 días pt volvió a ser detectada la presencia de Mycoplasma spp. en la línea celular. Por otro lado, el tratamiento 2 resultó ser efectivo luego de los 14 días de aplicación y logró mantener a la línea libre de contaminación los días 7, 21 y 28 pt (fig. 1). En los cultivos donde resultó efectivo el tratamiento, se evaluó la expresión de la enzima CYP19A1, como marcador fenotípico característico de la línea. Los resultados de la ICQ mostraron que el tratamiento no alteró la expresión de la enzima aromatasa (fig. 2).En conclusión, se pudo realizar un tratamiento antibiótico efectivo para descontaminar la línea celular BGC-1. Además, el tratamiento no alteró la característica fenotípica principal de la población celular. Estos resultados nos permiten contar con un sistema in vitro confiable para el desarrollo de modelos experimentales y la evaluación de diferentes vías de interés asociadas a la reproducción bovina.