Suplementación de semen sexado bovino con Retinol: evaluación de muerte celular mediante citometría de flujo

VARELA ML; CAINELLI S; GRÖTTER L ; OLMOS NICOTRA F; RENNA MS; BARBERIS F; CATTANEO L; MACIEL M; ORTEGA HH; REY F; GAREIS N

Esperanza

Jornada; IX Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión; 2021

Facultad de Ciencias Veterinaria - Universidad Nacional del Litoral

El uso de semen sexado (SS) ha cobrado gran relevancia en las explotaciones lecheras al permitir la obtención de un mayor número de hembras disponibles para reposición y acelerando el progreso genético. Sumado a los daños por congelación, el sexado somete a los espermatozoides a eventos que pueden desencadenar un aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS - del inglés ?reactive oxygen species?) y, en consecuencia, reducen la calidad del mismo. Muchos componentes celulares espermáticos pueden verse afectados por el estrés oxidativo, como por ejemplo el ADN, sin embargo, la membrana plasmática, al poseer alto contenido de ácidos grasos insaturados (AGI), es un blanco frecuente de los efectos perjudiciales de las ROS 1 . La consecuencia del daño oxidativo es una reducción del recuento y actividad espermática, disminución de la motilidad y morfología anormal. El semen posee componentes enzimáticos y no enzimáticos que funcionan como un sistema antioxidante protector, como la superóxido dismutasa, la catalasa, la Vitamina E y la Vitamina A o Retinol. La adición de antioxidantes a los medios de cultivo en programas de producción de embriones in vitro podría ser útil para proteger a los gametos masculinos del daño oxidativo a fin de mantener su integridad y lograr la fertilización y el desarrollo embrionario. Los carotenoides son antioxidantes naturales, responsables de mantener la integridad de las membranas celulares y están involucrados en la regulación de la espermatogénesis. En estudios previos realizados in vitro, los retinoides se han utilizado en ovocitos y embriones, aliviando los efectos negativos del estrés oxidativo, mejorando la maduración y aumentando las tasas de desarrollo embrionario. Maya-Soriano y col. 2 demostraron que el uso de retinol como suplemento para el almacenamiento de espermatozoides epididimarios de toros sometidos altas temperaturas, mejoró la estabilidad de sus membranas acrosomales. En estudios recientes, el retinol protegió a los espermatozoides humanos del daño de las ROS mejorando la actividad de las enzimas antioxidantes, proporcionando evidencia de la eficacia de la vitamina A como herramienta terapéutica para mejorar la calidad del esperma 3 . El objetivo de este trabajo fue analizar el efecto de la suplementación con diferentes dosis de retinol al semen sexado descongelado sobre los índices de muerte celular por apoptosis mediante citometría de flujo. El estudio se realizó utilizando pajuelas de SS de 5 toros Holando Argentino. Las pajuelas se descongelaron en un baño de agua a 37°C durante 30 seg. El semen se colocó en 1 mL de medio de lavado (FERT) y se centrifugó a 2500 rpm durante 5 min. Después del lavado, los pellet celulares se resuspendieron en 1 ml de medio FERT y se realizó el recuento de espermatozoides en cámara de Neubauer. Posteriormente, se plaquearon 100.000 espermatozoides por pocillo (placa de 96 pocillos de fondo en U) y se centrifugó la placa a 800g por 5 min. Luego de retirar el sobrenadante, los pellets de espermatozoides fueron resuspendidos en sus respectivos tratamientos: Grupo 1: Control (FERT sin Retinol), Grupo 2: Retinol 0,01 uM, Grupo 3: Retinol 0,05 uM, Grupo 4: Retinol 0,1 uM. La placa se incubó durante 60 minutos en estufa a 37 ºC con 5% de CO 2 . Para evaluar los porcentajes de espermatozoides viables, apoptóticos y/o necróticos luego de los diferentes tratamientos, se utilizó un kit comercial Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abcam) y la muerte celular se evaluó por citometría de flujo. Cuando la célula inicia el proceso de apoptosis, ocurre la translocación de la fosfatidilserina (PS) desde la cara interna de la membrana celular a la superficie externa de la misma. Una vez en la superficie, la PS puede ser fácilmente detectada por Anexina V/FITC, una proteína que tiene alta afinidad por ella, permitiendo la detección de células en apoptosis temprana mediante citometría de flujo. Por otra parte, en apoptosis tardía y/o necrosis, la integridad de la membrana plasmática y nuclear disminuye, permitiendo que el ioduro de propidio (IP) ingrese a la célula, se intercale entre los ácidos nucleicos, y aumente su fluorescencia unas 20 a 30 veces. Por lo tanto, luego de la incubación de los espermatozoides con los diferentes tratamientos, se centrifugó la placa a 800g por 5 min, se descartaron los sobrenadantes y se agregaron 100 uL de Buffer Binding 1X (BB1X) conteniendo 0,5 uL de Ioduro de Propidio (IP) y 0,5 uL de Anexina V-FITC en cada pocillo. La placa se incubó durante 15 min a 37°C en oscuridad para finalmente adquirir las células en el citómetro de flujo Attune NxT, analizándose un total de 10.000 espermatozoides por pocillo. Las muestras se evaluaron por triplicado. Los datos obtenidos fueron analizados utilizando un software específico (FlowJo, TreeStar Inc., Ashland, EE. UU) y se evaluó el porcentaje de células AnV+/IP- (espermatozoides en apoptosis temprana), células AnV+/IP+ (espermatozoides en apoptosis tardía), células AnV-/IP+ (espermatozoides muertos por necrosis) y células AnV-/IP- (espermatozoides viables) (Figura 1). Para la evaluación estadística se utilizó el programa SPSS 11.0, aplicando ANOVA y posteriormente el post-test de Duncan. No se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de células viables, en apoptosis temprana, tardía y/o necrosis entre los distintos tratamientos (p>0,05) (Figura 2). Según estos resultados el Retinol no alteraría la viabilidad de los espermatozoides sexados descongelados, ni tampoco induciría muerte celular por apoptosis y/o necrosis.