PRODUCCIÓN DE UNA LÍNEA CELULAR FIBROBLÁSTICA INMORTAL PARA APLICACIONES TRANSGÉNICAS EN LA ESPECIE BOVINA

CAPELLA V.; OLMOS NICOTRA MF; BOSCH P; RODRIGUEZ N

La Plata

Congreso; 1er Congreso Nacional de Estudiantes de Ciencias Exactas; 2013

Movimiento de Participación Estudiantil-Universidad Nacional de La Plata

Las líneas celulares primarias poseen una vida finita bajo condiciones in vitro debido a la senescencia replicativa, lo que impide la introducción de modificaciones complejas. Una alternativa a este impedimento es la introducción del gen de la telomerasa transcripta reversa humana (hTERT), la subunidad activa de la telomerasa, que posee actividad polimerasa RNA-DNA dependiente y adiciona así desoxirribonucleotidos en los extremos de los telómeros que se pierden por la incapacidad de la ADN polimerasa de sintetizar en dirección 3´→5´. El objetivo del presente proyecto es la producción de una línea celular bovina inmortal mediante la expresión forzada de la subunidad catalítica de la enzima TERT humana (hTERT). Se utilizan cultivos de fibroblastos bovinos, provenientes de biopsias de piel de bovinos adultos, crecidos en medio D-MEM con 10% de SFB hasta el 70-80% de confluencia, y se transfectan con 2 plásmidos, propagados en E.Coli DH5a. Uno de ellos es: pZGreen1N1, que posee un casete para la expresión de la proteína verde fluorescente y otro para la neomicinafosfotransferasa (resistencia a Neomicina) y el otro pCIneo-hEST2, con casete para la expresión de hTERT y resistencia a neomicina. Previo a la incorporación de dichos plásmidos a las células bovinas, los mimos son identificados mediante restricción por endonuclesas. Se realiza mediante 2 técnicas, una de ella física (electroporación), estudiando distintos voltajes, cantidades, intervalos y longitudes del pulso, y la otra química, (Lipofectamine 2000), probando distintas concentraciones para su puesta a punto. Las líneas celulares transgénicas se seleccionan mediante selección con G418 (análogo a neomicina) y se determina la integración de la construcción pCI neo-hEST2 mediante PCR. Comprobada la incorporación del transgen al genoma, se procede a la expansión de la líneas celulares para así lograr su inmortalidad.Resultados. Como primera instancia se identifican los plásmidos mediante restricción con enzimas. Para comprobar la identidad del plásmido pCIneo-hETS2 (Figura 1A) se sometió a un doble clivaje con las enzimas EcoRI y SalI, generando dos fragmentos, uno de 3500 pb y otro del 5450 pb como se esperaba (Figura 1B).Se ha obtenido previamente, en el grupo de trabajo, líneas poli-clonales de fibroblastos fetales bovinos, transfectadas con los plásmidos pZGreen1N1 y pCIneo-hEST2 (Figura 2), las cuales fueron obtenidas después de 21 días de selección con G418 (250µg/mL). En algunos casos, las células luego de 10 días de selección entraron en senescencia (Figura 3). Resultados esperados Sentar las bases para el desarrollo de nuevas tecnologías para lograr desarrollar métodos que prolonguen la vida media de los cultivos primarios bovinos o que otorgaría un margen de tiempo mayor para manipulaciones genéticas in vitro.