Validación de dos métodos automatizados para la detección de molecular de Trypanosoma cruzi en muestras de sangre.

ALEJANDRO FRANCISCO BENATAR; SUSANA, ALICIA BESUSCHIO; ALEJANDRO GABRIEL SCHIJMAN

Resistencia, Chaco

Congreso; XXX reunión anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2018

Sociedad Argentina de Protozoología

Las técnicas moleculares, y particularmente la PCR han demostrado una enorme utilidad para la detección de T. cruzi. En diversos trabajos hemos venido utilizando una técnica validada para el seguimiento de pacientes transplantados, para la detección en pacientes congénitos, y para la validación de ensayos clínicos para el desarrollo de nuevos tratamientos. Con el objetivo de mejorar los parámetros de sensibilidad, especificidad, y el tiempo de procesamiento de muestras, decidimos validar dos métodos automatizados de extracción de ADN con partículas magnéticas, utilizando un robot comercial de la marca Thermo King Fisher duo. Los métodos 1 y 2 se realizaron utilizando los kits Thermo Magjet Whole Blood, y Allmag Blood Genomic DNA, respectivamente. El método manual de referencia (Ref) se hizo con el kit Roche High Pure PCR preparation Kit. Trabajamos con tres tipos de muestras: 1) paneles de sangre-EDTA contaminada artificialmente con concentraciones conocidas de epimastigotes de T. cruzi, congeladas a -20ºC; 2) paneles de sangre + buffer Guanidina-EDTA (GEB) contaminada artificialmente con concentraciones conocidas de epimastigotes de T. cruzi conservadas a 4ºC; 3) Muestras de sangre-EDTA de pacientes a ciego, congeladas a -20ºC. Los ADN obtenidos por los métodos 1, 2 y Ref, fueron testeados por medio de PCR multiplex en tiempo real. La técnica mostró una utilidad limitada para paneles de sangre con EDTA, debido a la mayor dispersión del método 1 (R2 de 0,853) respecto del método Ref (0,988), y a la presencia de interferentes que hacen imposible procesar algunas muestras. Las interferencias fueron mayores para el método 2, por lo que descartamos su utilización con EDTA como anticoagulante. Similares resultados se obtuvieron con muestras de pacientes a ciego encontrándose concordancia en 58 muestras sobre 66 totales, con una menor sensibilidad para el método 1 que para el de referencia. En cuanto a los paneles con GEB, el método 1 no demostró utilidad, debido a la presencia de interferentes de la PCR. El método 2, en cambio demostró una performance similar al método Ref para dichos paneles, con similar dispersión de los datos (R2 de 0,997 vs 0,994), y permitió detectar muestras a concentraciones tan bajas como 0,125 equivalentes parasitarios/ml. A esto se suma una mayor velocidad de procesamiento, lo que sugiere una utilidad para su utilización en ensayos clínicos. En el futuro evaluaremos variaciones de ambos métodos para intentar mejorar sus parámetros.