Silenciamiento génico en la arquea halófila Haloferax volcanii utilizando tecnología CRISPRi

CERLETTI, MICAELA; GIMÉNEZ, MARÍA INÉS; COSTA MARIANA; BAUER, JULIUS; DE LUCA, LARA; FERNANDEZ, GONZALO; FRECHA, SOFIA; GONZALEZ B, LUCIA; LANDABURU, MARIANA; LORENZANI, SALVADOR; PRADO, MAIRA; SCHIEL, PAULA; FERRARI, CELESTE; ROSANA E. DE CASTRO; PAGGI, ROBERTO A.

Mar del Plata

Encuentro; XVI Encuentro de Biólog@s en red; 2022

Las prácticas de laboratorio (PL) como estrategia didáctica implican un proceso de enseñanza-aprendizaje dinámico. Esto permite a los estudiantes realizar acciones psicomotoras y sociales a través del trabajo colaborativo (desarrollo de la parte experimental), asociar diversas fuentes de información para generar nuevas concepciones y afianzar conceptos teóricos (elaboración de un informe). Basados en esto, en la asignatura Biología y Bioquímica de los Microrganismos generamos esta PL para conceptualizar el silenciamiento génico a través de la inactivación de un gen mediante ARN de interferencia (ARNi).En los últimos años se ha adaptado el sistema CRISPR-Cas, que representa el sistema inmune adaptativo de bacterias y arqueas, con el propósito de silenciar genes específicos (CRISPR de interferencia, CRISPRi). El sistema CRISPR-Cas en Haloferax volcanii fue modificado para la represión de genes en plásmidos o cromosoma. Estudios realizados por nuestro grupo de Investigación mostraron que la biosíntesis de pigmentos carotenoides en H. volcanii, entre otros procesos, está regulada por la proteasa de membrana LonB.Se plantearon los siguientes objetivos para la PL a) generar una cepa mutante con expresión reducida del gen lonB en H. volcanii mediante CRISPRi; b) comprobar el silenciamiento del gen lonB mediante Western blot (WB); c) determinar el efecto del silenciamiento sobre la síntesis de pigmentos y velocidad de crecimiento.Los estudiantes se dividieron en grupos y llevaron a cabo los protocolos que les permitieron transformar H. volcanii con tres ARNi, analizar el fenotipo de las transformantes, realizar un WB con anticuerpos anti-Lon, monitorear el crecimiento, extraer y calcular la concentración de pigmentos en las cepas control y silenciadas como métodos para determinar el silenciamiento de lonB y su efecto en la fisiología. Como resultados se obtuvieron cepas con expresión reducida del gen de la proteasa lonB en H. volcanii con dos de las construcciones comprobando el silenciamiento mediante WB. Por otro lado, se determinó que el silenciamiento produjo un aumento en la concentración de pigmentos y una disminución en la velocidad de crecimiento.Educación y ExtensiónTrabajo inédito