Las nucleósido difosfato quinasas de Trypanosoma cruzi mantienen la homeostasis energética celular? ¿Sólo eso?

MIRANDA, MARIANA; CANEPA, GASPAR; BOUVIER, LEÓN ALBERTO; PEREIRA, CLAUDIO

Buenos Aires, Argentina

Jornada; VI Jornadas científicas del instituto de investigaciones medicas Alfredo Lanari; 2007

Introducción: Las nucleósido difosfato quinasas (NDPKs) son enzimas ubicuas, presentes en todos los organismos estudiados. Catalizan la interconversión de nucleósidos difosfato a trifosfato (ribo- y describo-) a través de reacciones de fosfotransferencia. Si bien estas enzimas intervienen sólo en el mantenimiento de la homeostasis celular de nucleosidos, algunas evidencias las han involucrado en otras funciones celulares. En este trabajo estudiamos dos isoformas de nucleosido difosfato quinasa de Trypanosoma cruzi denominadas TcNDPK1 y TcNDPK2, en cuanto a sus mecanismos de regulación, localizacion subcelular y nuevos roles a partir de su interaccion con moléculas de ADN. Objetivos: Caracterizar las nucleosido difosfato quinasas de Trypanosoma cruzi y ampliar los conocimientos sobre las funciones biologicas que estas enzimas llevan a cabo tanto en los parasitos como en otro organismos. Materiales y Metodos: la actividad NDPK fuemedida realizando un ensayo colorimetrico con enzimas acopladas,siguiendo la absorbancia a 340 nm. La localizacion subcelular se estudio a traves del patron de extracción con digitonina y por ensayos de Western Blot realizados utilizando sueros de ratones inmunizados con las correspondientes proteinas recombinantes. Los ensayos de interacción con ADN fueron llevados a cabo incubando NDPKs recombinantes con ADN en diferentes topologías y condiciones. Posteriormente los ensayos son resueltos en geles de agarosa. Resultados y Conclusiones: En base a la ?minería de datos? realizada en el proyecto genoma de T. cruzi, podrían existir 4 isoformas de NDPK, dos de las cuales fueron validadas bioquímicamente en este trabajo. Las dos isofomas denominadas TcNDPK1 y TcNDPK2 fueron clonadas y expresadas en sistemas heterólogos y mostraron actividad bioquímica NDPK. En base a la extracción diferencial con digitonina en muestras de epimastigotes de T. cruzi, la actividad nucleósido difosfato quinasa se localiza en multiples fracciones subcelulares de los parasitos. A su vez TcNDPK1 y TcNDPK2 difieren en sus mecanismo de regulación y expresión a lo largo del ciclo de vida del parasito. Sorprendentemente, TcNDPK1 (y no TcNDPK2) puede unirse y clivar moléculas de ADN en distintas topologias. Estos resultados sugieren nuevas funciones biologicas para esta enzima, probablemente no asociadas al rol que cumplen en la homeostasis energetica celular.