LA INDUCCION DE LA AUTOFAGIA EN CELULAS K562 PROMUEVE LA FUSION ENTRE VACUOLAS AUTOFAGICAS Y CUERPOS MULTIVESICULARES

FADER CM, SANCHEZ D AND COLOMBO MI.

Universidad Nacional de Cuyo

Jornada; XX Jormadas de Investigación de la Universidad Nacional de Cuyo; 2006

Secretaria de Ciencia y Técnica. Universidad Nacional de Cuyo

Durante el proceso de maduracion de las celulas eritropoyeticas algunas proteinas de membrane y algunas organelas, son eliminadas. Las proteinas son secretadas al medio extracelular asociadas a pequeñas vesiculas, las cuales se forman por invaginacion de la membrana endosomal, hacia el interior del endosoma y posterior corte, formando los cuerpos multivesiculares (MVBs), fusionandose con la membrana plasmatica y liberando estas vesiculas internas llamadas exosomas. Tambien seha demostrado que durante la maduracion eritroide la autofagia es requerida para eliminar ciertas organelas como ribosomas y mitocondrias. La autofagia es un proceso degradativo normal, el cual involucra el secuestro de componentes citosólicos y organelas dentro de una vacuola llamada autofagosoma, la cual finalmente se fusiona con el lisosoma para degradar el material secuestrado. En este trabajo nosotros analizamos como la estimulacion de la autofagia por medio de la privación de nutrientes afecta el desarrollo de los MVBs en celulas K562 (eritroblastos leucémicos humanos), que sobreexpresan tanto marcadores de MVBs (GFP-Rab11WT) como RFP-LC3 (un marcador especifico de autofagosomas). Comparamos tanto las células K562 como células CHO (células de ovario de hámster chino) que sobreexpresan la proteína RFP-LC3 y determinamos que las células K562 poseen elevados niveles de autofagia basal. Por otro lado, la privación de nutrientes provocó un agrandamiento de vacuolas decoradas con GFP-Rab11WT y RFP-LC3, comparado con su control. Un efecto similar fue obtenido cuando a las celulas cotransfectadas se las incubó en medio de ayuno y vinblastina (una droga que despolimeriza microtubulos). La colocalizacion de RFP-LC3 con GFP-Rab11WT fue inhibida por wortmanina, la cual causó un agrandamiento de vacuolas decoradas con GFP-Rab11. Asi mismo, el silenciamiento génico de la proteína Atg12 endógena (una proteína esencial para la formación del autofagosoma) por un siRNA, mostró una marcada disminución de la distribución puntiforme de la proteína tanto en condiciones controles como en presencia de medio de ayuno. Por otro lado, determinamos mediante la utilización de Fluo3AM(un indicador fluorescente de calcio) y BAPTA-AM (un quelante de calcio) que la fusión de vesículas autofágicas con los MVBs seria un proceso dependiente de Ca+2. Al cuantificar la liberación de exosomas en células K562 transfectadas con GFP-Rab11wt, con RFP-LC3 o con la mutante de LC3 (LC3G120A), la cual no interactúa con autofagosomas, observamos que la sobreexpresion de LC3, asi como la inducción de la autofagia (ayuno) provocaron una disminución de la liberación de exosomas , sin embargo este efecto no fue observado en células que sobreexpresaban la mutante LC3G120A. Estos resultados nos sugiere que la inducción de la autofagia desviaría los MVBs a la ruta autofágica con la consecuente disminución de la liberación de exosomas.