Caracterización de la comunidad de micorrizas arbusculares en suelos contaminados con cromo: puesta a punto de la amplificación de ADN extraído de esporas

GIL CARDEZA ML, AMAYA MARTIN SA, GÓMEZ E

Jornada; Jornadas de Ciencia y Tecnología, Universidad de Rosario; 2015

Los hongos micorrícicos arbusculares (HMA) son microorganismos que sedesarrollan en las raíces del 70-90 % de las plantas terrestres, aún enambientes altamente degradados como son los suelos contaminados con elementospotencialmente tóxicos (EPTs). El efecto promotor del crecimiento vegetal delos HMA adaptados a sitios contaminados con EPTs los convierte en posiblesagentes biorremediadores ya que pueden colaborar en los procesos deestabilización y/o fitoextracción de los contaminantes. Estudios previos denuestro grupo de investigación, mediante el análisis de caracteres morfológicosde esporas de HMA, sugiere que las familias de Acaulosporaceae y Gigasporaceaeson las más sensibles a la presencia de cromo (Cr) en concentracionescontaminantes (> a  250 g Cr total *kg-1 suelo y > a 8 g Cr(VI) * kg-1 suelo, valoreslímites según ordenanza 831/93 ley número 24051). Sin embargo, el análisis de la diversidad mediante caracteresmorfológicos no posibilita la determinación de los HMA a nivel de especie y,dado que para la caracterización morfológica es necesario observar estructuraspresentes en los distintos estadios de maduración de las esporas, es común queuna proporción de los individuos quede sin identificar. La secuenciación degenes ribosomales permite la caracterización de HMA a nivel de especie y es porello que se ha convertido en una herramienta ampliamente utilizada paradeterminar la diversidad de los HMA en los ecosistemas. El objetivo del trabajofue el desarrollo de la técnica de amplificación de secuencias de ADN ribosomalesespecíficas de HMA a partir de esporas únicas. Las esporas se aislaron mediantela técnica de tamizado húmedo seguido de una centrifugación en sacarosa 70%  y observación bajo lupa en placa de Doncaster.Las esporas se transfirieron a vidrios de reloj estériles, se realizaron varioslavados con agua estéril para luego separar esporas únicas en tubos eppendorfde 200 µl. Se rompió cada espora mecánicamente con la ayuda de un tip estéril,se incubaron los tubos a 95ºC para desnaturalizar las ADNasas y se congelaron a-20ºC hasta su utilización. Finalmente se realizaron 2 reacciones de polimerasaen cadena (PCR) sucesivas: la primera con cebadores universales fúngicos(NS1-NS4) y la segunda con cebadores específicos de HMA (AML1-AML2). Seobtuvieron 42 reacciones de PCR positivas de un total de 109 esporas (40% deltotal) de 800 pb de longitud, indicando que la técnica desarrollada logróamplificar secuencias específicas de HMA extrayendo mecánicamente el ADN de esporasúnicas. La extracción mecánica de ADN a partir de esporas únicas es una técnicasencilla que permite la secuenciación directa de los amplicones, en cambio laextracción total de ADN de suelo requiere de un paso posterior, la clonación delos amplicones o un gel de poliacrilamida para separar los distintos ampliconesentre sí. En una etapa posterior se analizarán las secuencias amplificadas paracompletar la caracterización de la comunidad de HMA adaptada a concentracionescontaminantes de Cr.