Aspectos funcionales y sistemáticos de una simbiosis molusco - cianobacteria

FEDERICO A. DELL AGNOLA; ISRAEL A. VEGA

Mendoza, Argentina

Jornada; XI Jornadas de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas; 2010

Facultad de Ciencias Médicas - UNCuyo

INTRODUCCIÓN Pomacea canaliculata es un gasterópodo de agua dulce que habita principalmente ambientes lénticos, y que se distribuye en regiones templadas, subtropicales y tropicales de la cuenca inferior del Amazonas y del Plata.La glándula digestiva de P. canaliculata contiene corpúsculos pigmentados, descriptos por primera vez por Andrews (1964), que constituyen una décima parte de la masa glandular (Vega y col., 2005). Nosotros hemos caracterizado a estos corpúsculos como las formas vegetativas y quísticas de un simbionte afín al género de vida libre Microcystis (Chroococcales), (Vega y col., 2007). Esta simbiosis es la primera conocida de una cianobacteria con un molusco, y de las pocas conocidas con animales (Vega y col., 2006). Uno de los tópicos más interesantes de la teoría simbiótica es evaluar las posibles ventajas fisiológicas que surgen de esta asociación simbiótica, particularmente si el simbionte es capaz de llevar a cabo el proceso fotosintético bajo las condiciones actuales, es decir dentro de las células de la glándula digestiva naturalmente protegidas de la luz por una gruesa concha. A nivel del posible significado funcional evaluamos las primeras dos etapas del putativo proceso fotosintético: (1) el ingreso de la luz debajo de la concha del molusco, (2) la presencia de clorofilas y ficobilinas, pigmentos necesarios para captar energía lumínica. También, en este estudio (3), hemos decidido investigar (por PCRs) la presencia de secuencias específicas de bacteria y cianobacterias en el gen que codifica para el 16S ARN ribosomal. Pretendemos con estos datos y aquellos correspondientes a la caracterización morfológica (ya hecha) y bioquímica (clorofilas y ficobilinas) del simbionte contribuir a la ubicación sistemática (4) del mismo. OBJETIVO GENERAL El objetivo general de este trabajo es realizar un estudio funcional y sistemático del endocitocianobionte de la glándula digestiva de Pomacea canaliculata. OBJETIVOS ESPECÍFICOS -Determinar la cantidad y la calidad de luz que llega debajo de la concha de P. canaliculata. -Caracterizar los pigmentos fotosintéticos presentes en el endocitobionte (morfo o corpúsculos C). -Analizar la presencia de secuencias específicas de bacterias y cianobacterias en el gen que codifica el ARN ribosomal 16S del endocitobionte de P. canaliculata. -Analizar el status sistemático del endocitocianobionte usando sus caracteres morfológicos (ya hecho), bioquímicos y moleculares (este estudio). MATERIALES Y MÉTODOS Para medir la RFA (μmol fotones/m2.s se utilizaron conchas vacías de la masa cefalopodal y perfectamente selladas, Luego, a través de pequeñas perforaciones se introdujo una sonda de fibra óptica con corrector de coseno conectada al espectrómetro Ocean optics USB 4000. Para la caracterización de los pigmentos, se obtuvieron extractos acetónicos y acuosos del simbionte aislado de la glándula digestiva. La caracterización involucró inicialmente espectros de absorción y fluorescencia y luego resonancia magnética nuclear de hidrógeno (RMN-H) y espectrometría de masa (EM). Para las reacciones de PCR utilizamos dos pares de iniciadores: 27f - 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ y 1525r - 5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’, se corresponden con secuencias muy conservadas del gen ribosomal 16S y abarcan casi la totalidad de la secuencia del gen (Weisburg y col., 1991); los iniciadores 106f - 5’-CGG ACG GGT GAG TAA CGC GTG A-3’ y 781r - 5’-GAC TAC TGG GGT ATC TAA TCC CAT T-3’, se corresponden con una región interna del gen ribosomal 16S y han sido descriptas como específicos de cianobacterias RESULTADOS Estimación de la cantidad y calidad de radiación fotosintéticamente activa (RFA) que ingresa al interior de la concha de P. canaliculata. Nosotros evaluamos el ingreso de RFA debajo de la concha del animal y cómo se distribuye dicha energía en función de las diferentes de onda. Ninguna diferencia estadísticamente significativa fue observada entre la RFA obtenida de los de los orificios realizados en diferentes posiciones anatómicas de P. canaliculata K (posición dorsal, ventral, espira y opérculo). Tampoco se observó diferencias de la RFA en función del sexo del animal, por tanto los valores fueron agrupados para obtener una RFA promedio. Este valor fue de 102,9 ± 13.2 y equivale aproximadamente al ~6.5 % de la RFA ambiental (1580). Adicionalmente, evaluamos la calidad de la luz que llega al interior de la concha de P. canaliculata. Los valores más bajos de irradiancia se observaron entre 400 - 550 nm, luego hubo un ascenso gradual y continuo que alcanzó su máximo en 800 nm y se mantuvo hasta los 850 nm (Imagen 1). Análisis de los pigmentos presentes en el morfo C del simbionte aislados de la glándula digestiva de P. canaliculata En primer lugar estudiamos los pigmentos solubles en acetona presentes en el morfo C del simbionte. En la Imagen 2 se muestran los espectros de absorción entre 350 y 800 nm expresados como el porcentaje del pico máximo de absorción a 410 nm. Adicionalmente se observó un segundo pico a 670 nm y elevaciones adicionales de menor cuantía en 440 nm, 470 nm, 540 nm y 605 nm. Este espectro fue semejante al observado para la molécula de clorofila a. Como una extensión de estos resultados, decidimos realizar un estudio de RMN-H y EM de la banda más abundante separada por TLC. La RMN-H de la banda 2 mostró señales que corresponden a 3 puentes metinos y al menos un grupo vinilo. El espectro de masa de impacto electrónico presentó un ión molecular de 604, mientras que el espectro de masa por FABS dio un ión molecular de 603. Ésta descripción es compatible con moléculas de clorofilas modificadas (a y b) que han perdido su magnesio como metal de coordinación y su grupo fitol (Imagen 2, B y C). En segundo lugar, realizamos un análisis de espectrometría y fluorometría de los extractos acuosos del morfo C del simbionte. La Imagen 3 muestra el espectro de absorción entre 400 y 750 nm de los pigmentos solubles en agua del simbionte y células de Nostoc sp. expresados como porcentaje del máximo de absorción. Las muestra de Nostoc sp. mostró dos picos bien desarrollados a ~615 y ~670 nm (trazo verde). El morfo C del simbionte, aislado de animales silvestre o laboratorio (trazo rojo y azul, respectivamente), mostró el mismo patrón que las células de Nostoc sp., aunque las elevaciones fueron más atenuadas (Imagen 3). Dada la sugestiva presencia de al menos una ficobilina (ficocianina absorve entre 615 - 620 nm) decidimos evaluar las propiedades fluorométricas del extracto acuoso. Nostoc sp presentó un pico de emisión de fluorescencia a los ~647 nm (exitación a ~618 nm) correspondiente a la ficocianina (datos no mostrados). Por su parte, ningún pico de emisión fue observado a ~647 nm, cuando excitamos los extractos acuosos de los corpúsculos C, pero si se observó un pico de emisión a ~682 nm (datos no mostrado). Este perfil se mantuvo a pesar de que aumentamos gradualmente la concesntración de sus proteínas solubles hasta ~50 veces por arriba de la concentración de proteínas deNostoc sp. Amplificación por PCR del gen que codifica para el RNA ribosomal 16S usando iniciadores para bacterias y cianobacterias El ADN molde extraído de cultivos de E. coli mostró una banda única de aproximadamente ~1500 pb cuando se utilizaron iniciadores para bacterias. Por su parte, una banda única de ~675 pb se observó usando ADN molde extraído de cultivo de Nostoc sp.. Estos mismos tamaños moleculares fueron encontrados cuando se utilizó ADN molde del simbionte usando iniciadores de bacterias (Imagen 4, izquierda) o cianobacterias (Imagen 4, derecha), respectivamente. CONCLUSIONES A nivel del significado funcional fue sorprendente detectar RFA debajo de la concha del animal. Un valor de RFA relativamente bajo (~6.5%) podría ser suficiente para que el simbionte logre superar el punto de compensación (gasto respiratorio igual a la ganancia por fotosíntesis), como ocurre efectivamente en algunas traqueófitas y cianobacterias. El simbionte tiene moléculas de clorofilas a y b modificadas comúnmente conocidas como feofórbidos. Estas moléculas han sido previamente descriptas en cianobacterias y en procariotas fotosintéticos y su presencia se asocia a un aumento del catabolismo de las clorofilas como consecuencia de una RFA de ~6.5%. Por su parte, ningún pigmento soluble en agua tipo ficobilina fue detectado. La amplificación del gen 16S ARN ribosomal, a partir del ADN del simbionte, ha sido descripta previamente (Vega y col., 2005). Por su parte, la amplificación de un producto de 675 pb usando iniciadores específicos de cianobacterias en ambos tipos morfológicos del simbionte, es un hallazgo nuevo de este estudio, el cual por sí mismo contribuye a reforzar el posible origen cianobacteriano del simbionte. Desde el punto de vista taxonómico hay dos órdenes de cianobacterias (Chroococcales y Pleurocapsales) que contemplan características morfológicas presentes en nuestro simbionte. Estos incluyen bacterias esféricas con un rango amplio rango de diámetro (2-30 Qm) que se dividen por gemación o brotación (Chroococcales) o fisión múltiple (Pleurocapsales). Desde el punto de vista bioquímico, nuestros hallazgos (clorofilas a y b modificadas y ausencia de ficobilinas) no son compatibles completamente con las cianobacterias actuales; ellas tienen clorofila a y ficobilinas, pero no clorofila b. Llamativamente, este perfil bioquímico está presente en un grupo de bacterias procariotas fotosintéticas (Prochlorales) filogenéticamente emparentadas a las cianobacterias (estudio del 16S ARN ribosomal), como así también, a los cloroplastos de algas y plantas superiores.