Diseño y evaluación de un protocolo para la extracción simultánea de múltiples proxies en heces: implicancias en investigaciones forenses

VELÁZQUEZ N.J.; PETRIGH, R.; BENVENUTO, L.; MARTÍNEZ TOSTO, C.; CAMIOLO, I.; PALACIO PATRICIA, I.; FUGASSA, M.H.; VALENZUELA,L.; DE MIRANDA CHAVES, S.; GUICHÓN, R.; BURRY, L.S.

Sao Paulo

Encuentro; PAMinSA VIII; 2019

Estudios sobre restos de heces halladas en escenarios forenses han mostrado la potencialidad del análisis interdisciplinario en el esclarecimiento de casos. Estos estudios no poseen diferencias sustanciales con el análisis simultáneo de múltiples proxies de coprolitos (ADN, fragmentos vegetales, isótopos estables de carbono y nitrógeno, polen, silicofitolitos y restos parasitarios). La metodología para el análisis de coprolitos consiste en: 1. eliminación del córtex y división en submuestras para extracción multiproxy; 2. defloculación y extracción con sustancias químicas; 3. concentración y observación microscópica. Este procedimiento, muchas veces, produce pérdida de muestra impidiendo la cuantificación. Con el objetivo de sumar más líneas de evidencia, se diseñó y optimizó un protocolo de procesamiento de extracción conjunta de diferentes proxies a partir de una muestra mínima de heces que resultaría aplicable para el esclarecimiento de casos en escenarios forenses. Se procesaron heces de Lama guanicoe (Familia Camelidae) recolectadas en el noroeste de Santa Cruz, Argentina (47º00?S; 72º15?O). Las siguientes consideraciones se tuvieron en cuenta: la fisiología digestiva de L. guanicoe, n° de heces para procesar, composición y tiempo necesario de rehidratación de las heces, unificación de metodologías, representatividad y distribución de cada proxy, propiedades físico-químicas de los proxies, compatibilidades de las diferentes soluciones utilizadas, evaluación de pérdida de diferentes proxies en cada paso, índicesde refracción de cada proxy para su observación microscópica.El protocolo multiproxy consensuado consistió en: 1. registro del peso de las heces, caracterización morfométrica y organoléptica, 2. separación y almacenamiento del córtex, 3. división en dos secciones, una para la determinación del origen por ADN, y otra para el análisis de fragmentos vegetales, isótopos estables de C y N, polen, silicofitolitos y restos parasitarios, 4. registro del peso de ambas secciones, 5. adición de tableta de esporas de Lycopodium clavatum y rehidratación con fosfato trisódico acuoso 0.5% a 4°C por 5 días, 6. agitación, 7. filtración utilizando malla de 250 μm, 8. recuperación de los restos retenidos en la malla mediante lavados con PBS 1X para el análisis microhistológico, de silicofitolitos e isótopos de C y N, 9. centrifugación a 1500 rpm por 10 min, 10. realización de preparados con aceite de inmersión para la observación microscópica de silicofitolitos y restos parasitarios, 11. extracción polínica mediante acetólisis, 12.realización de preparados semipermanentes. Se confirmó origen zoológico de las heces y se determinó presencia de ADN necesario para el análisis. Se almacenó la muestra para el análisis de isótopos estables. Se reconocieron fragmentosvegetales a nivel específico de Poaceae, Juncaceae y Apiaceae. Se identificaron silicofitolitos de Poaceae (Pooideae y Stipoideae) y especies dicotiledóneas. Se observaron tipos polínicos arbóreos (Nothofagus), arbustivos (Empetrum y Mulinum) y herbáceos (Caryophyllaceae y Poaceae). Por último, se registraron huevos de nematodes Capilláridos. El análisis permitió sustentar la Identificación del origen zoológico por ADN, determinar items de dieta a diferente resolución taxonómica, inferir el rango de acción y registrar parasitosis en guanacos. Este protocolo multiproxy podría ser considerado para la definición del contexto forense y sumar evidencias para la resolución de casos judiciales.