Utilización de la distribución genómica de SIRE y polimorfismo del fragmento A10 de Trypanosoma cruzi para el diseño de marcadores moleculares de linaje

DUFFY T, BURGOS JM, BISIO M, DIOSQUE P, MEJIA AM, BASOMBRIO MA, TRIANA O, LEVIN MJ, SCHIJMAN AG. O

Mendoza, Argentina

Congreso; VII Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2005

Sociedad Argentina de Protozoología

La variabilidad genética de Trypanosoma cruzi es una de las características parasitarias implicadas en el amplio espectro de manifestaciones clínicas de la enfermedad de Chagas. Los distintos clones y aislamientos de T.cruzi pueden agruparse en 6 linajes, TC1, TCIIa, TCIIb, TCIIc, TCIId y TCIIe. Nuestro laboratorio se ha sumado al trabajo de otros grupos con el objeto de desarrollar, mejorar y evaluar distintos marcadores moleculares para identificar linajes no solo a partir de parásitos en cultivo sino con particular énfasis en muestras biológicas. Sin embargo, estos sistemas aún no son capaces de discriminar con certeza ciertas infecciones con sublinajes IId de infecciones mixtas con IId más IIb o IIe. Las secuencias repetitivas conforman una porción substancial del genoma de Trypanosoma cruzi y se encuentran distribuidas a lo largo de todo el genoma. Una de las más representadas es SIRE (short interspersed repetitive element), con 1500-3000 copias por genoma presentes en todos los cromosomas. Con el objetivo de encontrar nuevos marcadores moleculares para identificar linajes de Tcruzi, se analizó la distribución y estabilidad de SIRE en cepas representativas de cada uno de los linajes por 1) Southern Blot utilizando como sonda el elemento SIRE de 430 bp obtenido de un pool de secuencias SIRE de distintos linajes y 2) realizando una PCR Inter-SIRE (amplificación de zonas flanqueadas por SIRE)  con primers INSF:  5`tccatagat(t/a)atttcaggatcc 3` y INSR: 5`attaagttagccagctct(a/c)cc 3` ubicados sobre los extremos del elemento. Se observó una distribución diferencial del SIRE en los genomas analizados con una alta estabilidad para una misma cepa después de numerosas generaciones. Se clonaron amplicones inter-SIRE diferenciales entre cepas IId, IIb y IIe para su caracterización y alineamiento con el genoma de CL-Brener (IIe). Se seleccionaron 3 secuencias; IS-1 y IS-2 fueron halladas en CL-Brener pero no asociadas a SIRE, por lo cual el fragmento IS equivalente en CL-Brener no es amplificado con los primers INS. Este resultado se validó con otras cepas IIb y IIe que mostraron resultados idénticos. El producto IS3 presentó una secuencia diferencial entre linajes IId y IIe constituído por repeticiones CTA. A partir de esta secuencia se diseñaron primers internos para desarrollar una heminested IS-PCR discriminatoria de estos linajes. Estos nuevos marcadores moleculares serán incorporados a un algoritmo de tipificación de linajes por ensayos de PCR