Actividad de beta-galactosidasa en interface lípido-agua: Existen diversos niveles de control?

CICLICK I; SÁNCHEZ J; TURINA A. DEL V.; PERILLO M.A.

Ciudad. Universitaria. Córdoba, Argentina.

Jornada; XIII Jornadas Científicas de la Sociedad de Biología de Córdoba; 2001

En trabajos previos demostramos que b-galactosidasa es capaz de interactuar con biomembranas. El tipo de interacción (penetración o adsorción) depende de la organización y de la composición de la membrana y modula diferencialmente la actividad de la enzima contra sustratos solubles (Sanchez y Perillo 2001, Coll.Surf., en prensa). En sistemas complejos como los constituidos por suspensiones de membranas, no sólo la enzima sino también el resto de las especies químicas que participan de la reacción podrían eventualmente particionarse en la interfase lípido-agua. En este caso los equilibrios de partición y las barreras de difusión contribuirían, conjuntamente con cambios en el mecanismo intrínseco de la reacción, a la modulación de la cinética de hidrólisis del sustrato. El objetivo del presente trabajo fue evaluar cuantitativamente esta hipótesis. Se realizaron dos tipos de experimentos: I) determinamos los valores de coeficiente de partición membrana-agua (Pm/w) del sustrato (ONPG), del producto orto-nitro fenol (ONP) y de la enzima (Perillo y Arce, 1991, J.Neurosci.Meth.36:203) Como modelo de membrana, se utilizaron vesículas multilamelares (MLVs) de fosfatidilcolina de soja (PC) . Las MLVs (1mg PC/ml) se incubaron a 21°C por 15 min. en presencia de la droga a concentraciones variables. Las fracciones de droga libre y la unida a membrana fueron separadas por centrifugación a 18.000xg por 30 min. La cantidad de droga unida se cuantificó por espectrofotometría VIS. Este valor se graficó en función de concentración de droga total en el sistema, y a partir de su pendiente se calculó Pm/w. La pendiente corresponde a Pm/bfm+Cfa (siendo fm y fa las fracciones del volumen total del sistema que corresponden a las fases membrana y agua respectivamente y C es la fracción del volumen de sobrenadante que permanence retenido en el pellet). En un experimento paralelo, se determinó Cfa a partir de la pendiente de un gráfico similar, utilizando una sustancia hidrofílica (K2CrO7) cuyo P=0. Los valores obtenidos fueron 0, 50 y 118 para ONPG, ONP y b-gal respectivamente. II) Investigamos la localización de ONP (cuyo Pm/w resultó >0), por medio del analisis de los efectos sobre su equilibrio ácido-base inducido por la partición (García y Perillo, 1997. BBA, 1324:76). A partir de la titulación de ONP entre pH 0.5 y 9.6, en presencia y en ausencia de MLVs, se determinaron los valores de las constantes de equilibrio de disociación. La diferencia entre los valores de pK obtenidos con (pKm=5.7) y sin (pKw=5.6) MLVs se interpolaron en un gráfico de  DpK (diferencias entre pKw y los pK medidos en medios de polaridad conocida) vs constante dieléctrica (D). Se concluyo que ONP se localiza en la region de grupos polares de la membrana (D@70). Los Pm/w obtenidos se aplicaron a un modelo de dos compartimientos, considerando la existencia de un comportamiento nucleofilico ejercido por la región de grupos polares de la membrana capaz de inducir activación enzimática el cual reprodujo parcialmente el aumento en la Vmax que habíamos observado en función de la concertación de lípidos.