Modulación de la unión de Flunitrazepan al Receptor-GABAA inducida por el empaquetamiento molecular.

TURINA A. DEL V.; PERILLO M.A.

Hotel Portal del Lago -Carlos Paz, Cordoba, Argentina.

Congreso; XXXIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2005

En trabajos previos reportamos que moléculas que no se unen “específicamente” al el receptor GABAA, pero que se incorporan a membranas naturales y modelo,  modificando no sólo el potencial dipolar de las mismas  sino también su compresibilidad, afectaban la unión de Flunitrazepam (FNZ) al sitio “específico” para benzodiazepinas (BZD). Tomados en conjunto, estos resultados podrían ser considerados como el reflejo de la mecanosensibilidad del R-GABAA, tal como se describió para el receptor de NMDA y otras proteínas. De esta manera, la exposición del sitio de unión para BZD podría ser modulada por los cambios que inducen en el entorno del receptor las moléculas que se particionan a la membrana. Los estudios de unión de FNZ mencionados anteriormente  fueron realizados en membranas sinaptosomales (MS), donde no es posible separar los efectos de cambios en la curvatura de aquellos inducidos por la densidad molecular. El objetivo del presente trabajo fue evaluar  el efecto del empaquetamiento molecular sobre la accesibilidad a los sitios de unión de FNZ al R-GABAA, en condiciones de curvatura plana constante.  Se realizaron ensayos de unión de H3-FNZ a filmes de Langmuir Blodgett preparados a partir de MS y estos resultados se correlacionaron con imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) (experimentos preliminares). La composición de los filmes se evaluó por SDS-PAGE. Fue necesario desarrollar un método para realizar transferencias seriadas de filmes de Langmuir de MS a soportes hidrofóbicos, a los fines de contar con gran cantidad de muestras para los estudios cinéticos de unión ligando-receptor. Se transfirieron una (1c) o dos capas (2c), a una presión lateral constante p= 35 o 15 mN/m. Las membranas transferidas se conservaron a 4º C hasta su utilización. Se observó que: -La cinética de unión de [3H]FNZ al R-GABAA sufrió un cambio cualitativo cuando el empaquetamiento molecular aumentó de 15 a 35 mN/m. A 15 mN/m la unión específica mostró una tendencia de aumento lineal en función de la concentración de [3H]FNZ aunque no alcanzó una saturación. A 35 mN/m, tanto en filmes con 1c como con 2c, se observó una cinética sigmoidea.   -Los tamaños de las estructuras observadas en la AFM, sugieren que, tanto en los filmes transferidos a 15 como a 35 mN/m (1c), no habría ocurrido una reorganización molecular general hacia la forma de vesículas durante la transferencia desde la interfase agua-aire hacia el sustrato hidrofóbico. Sin embargo, a 35 mN/m 2c, esta afirmación podría ponerse en dudas. A una escala de 5 mm, se observó que la dimensión fractal (DF) y la rugosidad promedio (Ra) de los filmes LB de MS fueron mayores que las obtenidas para una foto tomada en un vidrio silanizado y sin membrana (vsm). Lo mismo ocurrió con los valores de ancho promedio de pico (AP) y la altura máxima (Hm). Si bien la Hm a 35 mN/m 2c fue de 409 nm el 80% de las estructuras fue <180 nm. Con 1c, Hm=90.3 nm con un 90% <46 nm. A 15 mN/m 1c, Hm= 154 nm pero el 90% <15 nm. En el vsm Hm=33 nm y el 80% <13 nm. En consecuencia: en los filmes LB las moléculas adoptaron una organización general compatible con filmes planos con alta anisotropía lateral y una dimensión fractal comprendida entre 2 y 3. La sigmoidicidad de la cinética de “binding” podría deberse a un efecto cooperativo similar al que expresan las enzimas alostéricas, reflejo de la mecanosensibilidad del R-GABA, o podría indicar que el orden cinético de unión del ligando se acopla a la dimensionalidad topológica fractal de la organización del entorno molecular del receptor.