Generación de un fragmento dimérico a partir de la disección de la proteína que une ácidos grasos de intestino (IFABP).

GISELA R. FRANCHINI; LUCRECIA MA. CURTO; JULIO J. CARAMELO; JOSÉ MA. DELFINO

La Plata

Congreso; XXXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2008

Sociedad Argentina de Biofísica

IFABP es una proteína intracelular que se expresa abundantemente en células del epitelio intestinal. Asimismo, representa un modelo muy reconocido para el estudio de proteínas de la clase b. Su estructura está conformada por un barril  formado por diez cadenas b con orientación antiparalela que delimitan la cavidad de unión del ligando y un subdominio a-helicoidal. Previamente, en nuestro laboratorio se aisló y caracterizó una variante abreviada, D98D, la cual carece de la región a-helicoidal y las hebras b responsables del cierre del barril (1). D98D ha demostrado ser monomérica, estable en solución y  capaz de unir ácidos grasos. La proteólisis parcial de D98D con Arg-C, demostró que, en presencia del ligando, perdura un fragmento resistente a una mayor degradación proteolítica. Este fragmento, denominado D78D, ha sido clonado, purificado y caracterizado. El mismo presenta una secuencia de 78 aminoácidos (29-106 de IFABP) y un peso molecular de 8807 Da por ESI-MS. El análisis estructural de D78D (dicroismo circular, espectros de absorción UV y fluorescencia intrínseca) indica que se ha preservado el contenido hoja-b y la estructura terciaria. Además, pese a presentar una menor afinidad, el fragmento mantiene la capacidad de unir ácidos grasos, así como también la sonda fluorescente ANS. Pero la característica más sobresaliente de D78D es que se halla estable en solución como un dímero levemente expandido. Esta condición se comprobó mediante experimentos de dispersión de luz, que indican la presencia de una población monodispersa correspondiente a un peso molecular de 19 kDa. En experimentos en equilibrio D78D se despliega por acción de urea y GdnHCl siguiendo transiciones de tipo cooperativo. Experimentos de estabilización covalente de D78D por reacción con disuccinimidil suberato (DSS) revelaron que a) esta forma sería dimérica hasta el punto en que transiciona hacia el estado desplegado, y b) el dímero exhibe mayor estabilidad en presencia del ligando ácido graso. Esto concuerda con datos espectroscópicos obtenidos en presencia y ausencia del ligando y con la mayor resistencia a la proteólisis con Arg-C de D78D incubado con ácido oleico. En conjunto estos datos revelan a D78D como un dímero constitutivo en solución, el cual incrementa su estabilidad en presencia del ligando.