Caracterización funcional de receptores colinérgicos nicotínicos recombinantes 42 con mutaciones puntuales en la región TM2.

M. MARCELA LIPOVSEK; ELEONORA KATZ; ANA BELÉN ELGOYHEN

Vaquerías, Córdoba

Workshop; Taller Argentino de Neurociencias; 2005

La acetilcolina (ACh) es un neurotransmisor que actúa sobre dos tipos de receptores con estructura y mecanismo de acción diferentes. Los receptores muscarínicos (mAChRs) son receptores metabotrópicos pertenecientes a la familia de receptores de siete dominios transmembranales acoplados a proteínas G. Los receptores nicotínicos (nAChRs) son receptores de tipo ionotrópico y pertenecen a la superfamilia de canales iónicos activados por ligando. Los nAChRs son complejos proteicos conformados por cinco subunidades. Las mismas atraviesan cuatro veces la membrana y participan en la formación del sitio de unión al ligando y en la formación del poro iónico, el cual se postula está tapizado por el dominio transmembranal 2 (TM2) de cada subunidad. El receptor nicotínico neuronal más abundante está conformado por las subunidades a4 y b2. Existen mutaciones en estas subunidades que están ligadas a un tipo de epilepsia familiar monogénica conocida como ADNFLE (Autosomal Dominant Nocturnal Frontal Lobe Epilepsy). Hasta el momento se han caracterizado tres mutaciones en la subunidad a4 y dos en la subunidad b2 ligadas a esta patología. Estudios realizados en oocitos de Xenopus laevis demostraron que las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas de receptores ensamblados a partir de subunidades recombinantes portadoras de dichas mutaciones se encuentran alteradas. No se ha encontrado aún una función alterada en común que permita comprender y definir el rol de los nAChRs en ADNFLE. Para reproducir el fenotipo humano de ADNFLE, se construyeron ratones ‘knockin’ para dos de las mutaciones descriptas en el gen de la subunidad a4: S248F y 776ins3. Ambas mutaciones se encuentran en el domino TM2. El objetivo del presente trabajo es estudiar, mediante la técnica de fijación de voltaje con dos microelectrodos, las características funcionales de los receptores recombinantes resultantes de la expresión heteróloga de clones de ratón con las mutaciones S248F y 776ins3 en la subunidad a4. Para esto, ovocitos de Xenopus laevis fueron inyectados con el cRNA de las subunidades a4 y b2, en relación 1:1 (receptor salvaje) o con el cRNA de las subunidades a4, a4 mutada y b2, en relación 1:1:2 (receptor mutado heterocigota). Las curvas concentración-respuesta para acetilcolina no arrojaron diferencias significativas en la afinidad por dicho ligando entre el receptor salvaje y ambos clones mutantes expresados en heterocigosis (EC50: salvaje = 4,31 ± 0,61mM; 776ins3 = 7,26 ± 1,39 mM; S248F = 3,59 ± 0,63 mM). No obstante, se observaron diferencias significativas en el patrón de desensibilización de los distintos receptores: ante aplicaciones prolongadas de ACh, los receptores con la mutación S248F presentaron una desensibilización más marcada que los receptores salvajes o con la mutación 776ins3 (IC50: salvaje = 0.73 ± 0.40 mM;  776ins3 = 0.14 ± 0.05 mM; S248F = 0.058 ± 0.011mM). La comparación de estos resultados con los datos publicados para los receptores salvajes y mutantes humanos permitirá fortalecer el modelo murino como una herramienta para el estudio de este tipo particular de epilepsia.