Reducción de la eficiencia catalítica de la Ferredoxin-NADP(H) reductase de arveja mediante la incorporación de un sitio metálico artificial

CATALANO DUPUY, D. L.; ORECCHIA, M.; RIAL, D V; CECCARELLI, E. A.

San Nicolás, Buenos Aires

Workshop; Workshop de Metaloproteínas Artificiales y Complejos de Coordinación; 2006

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Las ferredoxina-NADP+ reductasas constituyen una familia de proteínas hidrofílicasmonoméricas que contienen FAD no covalentemente unido como grupo prostético. Estasenzimas catalizan la transferencia de electrones reversible entre el NADP(H) y la proteínade Fe-S ferredoxina (Fd) o la flavodoxina (Fld), la cual contiene FMN.La FNR de cloroplastos consiste de dos dominios estructurales, deaproximadamente 150 aminoácidos cada uno: el dominio que une FAD (N-terminal) y eldominio que une NADP+ (C-terminal). La participación de diferentes aminoácidos en laestructura y función de la enzima ha sido estudiada mediante la introducción de diferentesmutaciones y deleciones. En la FNR de arveja el FAD, responsable de la transferenciaelectrónica durante la catálisis, se encuentra interaccionando con tres tirosinas altamenteconservadas (Y89, Y114 e Y308). La Tyr308 se encuentra enfrentando la cara re de laisoaloxacina, impidiendo su exposición con el exterior. La nicotinamida del NADP(H)desplazaría a la Tyr308 al fijarse a la enzima. Aunque existen evidencias al respecto, noexiste una demostración experimental directa de este movimiento. Este particularmecanismo estaría involucrado en la generación de una enzima catalíticamente eficiente,aumentando la Km de la enzima para el NADP(H).Con el fin de encontrar una evidencia experimental directa de este movimientopropuesto, se construyó una FNR recombinante en la cual el aminoácido carboxilo terminal(Tyr308) está seguido por un sitio metálico artificial compuesto de 9 aminoácidos entre losque se incluyen 4 residuos de histidina. Esta estructura adicionada es capaz de unir Zn2+ oCo2+ a bajas concentraciones, y como consecuencia, reduce fuertemente la eficienciacatalítica de la enzima. La afinidad de la enzima por NADP+ y la Km no fueron afectadassignificativamente por el agregado de esta extensión de aminoácidos tanto en ausenciacomo en presebcia de Zn2+. Los resultados obtenidos sugieren que la movilidad de laregión carboxilo terminal de la FNR y principalmente la Tyr308, son esenciales para obteneruna enzima altamente eficiente.