Utilización de la técnica LSSP-PCR para la tipificación de cepas de T. cruzi.

VELÁZQUEZ, M; DIEZ, C; MARCIPAR, I

Santa Fe

Otro; III Encuentro Bioquímico del Litoral y V Jornadas Técnico Científicas.; 2005

Se ha determinado experimentalmente que diferentes cepas de T. cruzi aisladas de pacientes con enfermedad de Chagas, presentan distintos grados de virulencia y de tropismo hacia los tejidos. La posibilidad de obtener una correlación entre la cepa infectante y la virulencia en estudios epidemiológicos, realizados en pacientes con Enfermedad de Chagas, permitirá determinar cuáles son los factores diferenciales responsables de la patogenia en el ser humano. Debido a la selección de cepas que se produce al utilizar la técnicas clásicas de aislamiento de microorganismos viables, se ha planteado la necesidad de clasificar los distintos aislados por técnicas moleculares que permiten la detección directa de material genético a partir de la muestra del paciente. Uno de los blancos moleculares más descriptos para este uso es el ADN kinetoplástico del parásito que, al estar repetido en miles de copias en cada parásito, permite su identificación con alta sensibilidad. Este ADN presenta en todas las cepas de T. cruzi, regiones altamente conservadas adyacentes a regiones hipervariables. Esto permite amplificar por PCR las regiones hipervariables de cualquier cepa y tipificarlas por distintas metodologías tales como sondas o fragmentos de restricción. Como nuevo criterio metodológico para la caracterización de cepas, se ha propuesto la LSSP-PCR (Low Stringency Specific Primer - PCR) que consiste en una primera amplificación del fragmento de interés, que luego es usado como molde en una seguna PCR, en condiciones de baja astringencia. Con el fin de realizar un relevamiento epidemiológico de cepas infectantes de T. cruzi en la región Noreste de nuestro país, en este trabajo se evaluó la LSSP-PCR en una primera instancia para diferenciar las cepas de referencia CL Brener y Tulahuen. Se realizó una PCR de 40 ciclos a partir de los fragmentos amplificados, con altas concentraciones del primer (cebador) S35G y una temperatura de unión de primer de 30°C. Bajo estas condiciones, el primer hibridizó específicamente a su región complementaria, e inespecíficamente a múltiples sitios dentro del fragmento, obteniéndose productos con secuencias heterogéneas. Los patrones de amplificación obtenidos permitieron la discriminación entre ambas cepas.