Caracterización de la Actividad Enzimática de DAminoácido Oxidasa en Solución y sobre Superficies Sólidas

HERRERA, ELISA G.; CAROT, M. LUCRECIA; GIACOMELLI, CARLA E.

Córdoba

Jornada; IV Jornadas de Posgrado; 2009

Escuela de Posgrado de la Facultad de Ciencias Químicas, UNC

CARACTERIZACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE D-AMINOACIDO OXIDASA EN SOLUCION Y SOBRE SUPERFIES SOLIDAS.    Elisa G. Herrera; Lucrecia Carot; Carla E. Giacomelli   INFIQC. Departamento de Fisicoquímica. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba. 5000. Córdoba. Argentina. mail: eherrera@fcq.unc.edu.ar       La D-aminoácido oxidasa (DAAO) cataliza la conversión de D-aminoácidos a sus correspondientes a-cetoácidos. La presencia de D-aminoácidos en fluidos cerebrales ha sido relacionada con diferentes desordenes mentales. Además, estos aminoácidos se utilizan como indicadores de la actividad bacteriana y los procesos de fermentación en alimentos. Por lo tanto, el desarrollo de una herramienta analítica para la detección y cuantificación de D-aminoácidos permitirá no sólo un mejor diagnóstico de enfermedades sino también una adecuada estrategia para determinar calidad y origen de alimentos. Una de las vías más eficiente para lograr alta especificidad y sensibilidad en los métodos de detección, es la adsorción (química o física) de una biomolécula (DAAO) sobre una superficie, para que actúe como el elemento de reconocimiento de un determinado analito (D-aminoácidos) presente en la muestra. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar la actividad enzimática de la DAAO, tanto en solución acuosa como adsorbida, para determinar las condiciones de pH y fuerza iónica óptimos que permitan mantener la capacidad de reconocimiento de la enzima sobre la superficie. La actividad de la enzima se analizó a través de la detección amperométrica del producto de reacción, H2O2, utilizando Análisis por Inyección en Flujo (FIA) en función del pH (5, 7 y 8,5) y de la fuerza iónica (5mM y 100mM). Se trabajó aplicando un valor de potencial constante de 0,8 V vs electrodo de Ag/AgCl, a temperatura ambiente utilizando D-alanina como sustrato. La actividad enzimática de la DAAO en solución acuosa depende del pH y aumenta ligeramente con la fuerza iónica. La mayor actividad se encontró a pH 8,5, tal como se ha informado utilizando otros métodos de determinación [Boselli, A., et al Biochimie 89 (2007) 360e368]. Por otro lado, se observa que la enzima adsorbida conserva la actividad enzimática. Es decir, la interacción DAAO-Sílica no produce cambios conformacionales significativos, que lleven a perder la estructura nativa de la proteína. Las determinaciones realizadas con el sistema FIA-amperométrico permiten obtener valores que siguen la tendencia de los resultados obtenidos por espectroscopía Uv-vis.