Inactivación térmica de la ATPasa soluble mitocondrial (F1). Caracterización cinética de un intermediario reversible

LAURA M. GASTALDI; ANABELLA F. LODEYRO; OSCAR A. ROVERI

Córdoba, ARGENTINA.

Congreso; XXXIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

La ATPasa soluble mitocondrial (F1) posee su máxima estabilidad a temperatura ambiente. Se inactiva rápidamente a 0ºC, inactivación cuyo mecanismo no ha sido completamente determinado. Si bien ha sido observado que la incubación a bajas temperaturas conduciría a la disociación irreversible de la enzima en subunidades (1), no se ha podido descartar que la misma fuera precedida por una etapa reversible consistente en cambio conformacional y/o disociación de nucleótidos firmemente unidos (2), de manera similar a lo postulado para la inactivación por altas temperaturas (3). Con el objeto de caracterizar cinéticamente la inactivación térmica de F1 en un rango de temperaturas (0 a 55ºC) que abarque tanto la inactivación por frío como por altas temperaturas, se incubó la enzima a las distintas temperaturas. A distintos tiempos se transfirieron muestras a un medio conteniendo ATP-Mg 100 µM a 30°C para determinar la velocidad inicial de hidrólisis de ATP. En todos los casos la actividad ATPásica no decayó de una manera exponencial simple con el tiempo de incubación. En cambio, un decaimiento exponencial a una asíntota distinta de cero pudo ser razonablemente ajustado a los puntos experimentales. El valor de la asíntota (actividad residual) mostró un máximo a 30ºC (0,90) disminuyendo tanto cuando se disminuyó (0,17 a 0ºC) como cuando se aumentó la temperatura (0,11 a 55ºC), resultado consistente con un modelo de dos etapas, la primera reversible y la segunda irreversible, con las siguientes características: 1) a las temperaturas ensayadas la velocidad de la etapa irreversible es mucho menor que las de la etapa reversible y por tanto la actividad residual es una buena estimación de la amplitud de la segunda exponencial del modelo; y 2) la constante de equilibrio para la etapa reversible aumenta con la disminución de temperatura a temperaturas inferiores a 30ºC y con el aumento de la temperatura a temperaturas superiores a 30ºC. Para determinar las propiedades cinéticas del intermediario reversible, F1 fue incubado a 10 y a 40ºC durante 120 min, al cabo de los cuales se determinó la dependencia de la actividad ATPásica con la [ATP]. Mientras la preparación incubada a 10ºC mostró diferencias significativas en los valores de Km2 y Vmax2 respecto del control (preparación incubada a 30ºC), la preparación incubada a 40ºC mostró sólo diferencias significativas en el valor de Vmax2. Este último resultado muestra que el intermediario en la inactivación por bajas temperaturas posee propiedades cinéticas distintas a las del intermediario obtenido durante la inactivación por altas temperaturas. Estos resultados sugieren que ambos procesos cursan por mecanismos distintos que difieren al menos en la naturaleza del intermediario reversible. 1.        Williams N, Hullihen, J, Pedersen P (1984) Biochemistry 23, 780-785. 2.      Rosing, J, Harris, DA, Kemp, A Jr, Slater EC (1975) Biochim Biophys Acta 376, 13-26. 3.      Villaverde, J, Cladera, J, Hartog, A, Berden J, Padrós, E, Duñach, M. (1997) Biophys J 75, 1980-1988.